長鏈脂酰輔酶A合成酶1在肝癌中的表達及臨床意義

李嬌嬌 師豆豆 黃啟超 陶梅

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)目前是全球第六大最常見的癌癥和第三大癌癥死因[1]。由于肝癌的生物學(xué)特性，放射治療和化學(xué)療法不敏感，手術(shù)切除仍是最有效的肝癌治療方法，但幾乎70%的患者在切除后發(fā)展為復(fù)發(fā)性HCC[2]。因此,發(fā)現(xiàn)新的預(yù)后靶點，將有助于提高HCC患者生存率。

哺乳動物體內(nèi)一共有26種脂酰輔酶A合成酶，其中長鏈脂酰輔酶A合成酶(ACSLs)主要負(fù)責(zé)活化最豐富的長鏈脂肪酸(C12 ～ C20脂肪酸)，活化的脂酰輔酶A通過參與脂質(zhì)合成或脂質(zhì)氧化來發(fā)揮生物作用。ACSL1是ACSLs家族中第一個發(fā)現(xiàn)的亞基，肝臟的ACSL1含量占ACSLs家族總含量的50%以上[3]。越來越多的研究表明，組織ACSL1的異常表達在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中占據(jù)重要作用。比如，在結(jié)腸癌[4-5]、甲狀腺癌[6]、卵巢癌[7]中，ACSL1促進癌細胞不受抑制的增殖，開啟不受調(diào)控的癌癥代謝，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移；在食管癌[8]、IDH1突變膠質(zhì)瘤[9]中，ACSL1與腫瘤的生存率和預(yù)后存在密切聯(lián)系。ACSL1在HCC中的作用尚不明確,且ACSL1在HCC中的表達情況尚存在爭議[10-11]。因此該研究通過檢測臨床HCC組織樣本ACSL1的表達并分析ACSL1對HCC患者預(yù)后的影響,在細胞層面觀察ACSL1對癌細胞增殖、凋亡、能量代謝的影響，初步探討ACSL1與HCC的關(guān)系及其對臨床診療的意義。

資料與方法

一、一般材料

(一)組織樣本及臨床病理資料 HCC手術(shù)組織及臨床資料來自空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院和唐都醫(yī)院2010年1月至2016年12月的HCC隊列，334例在肝膽外科診斷為HCC的癌組織及對應(yīng)的癌旁正常組織石蠟包埋組織。癌組織的石蠟包埋組織均經(jīng)病理檢查確認(rèn)，術(shù)前無放化療，不伴有其他惡性疾病。臨床資料包括患者的6年隨訪資料。該研究獲得空軍軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

(二)主要材料及試劑 人HCC細胞株 SNU739由空軍軍醫(yī)大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理實驗室贊助；胎牛血清、RPMI培養(yǎng)基、Trypsin-EDTA購自美國Gibco公司；ACSL1過表達的慢病毒質(zhì)粒購自上海吉凱基因公司；ACSL1抗體、MTS檢測試劑盒購自上海艾博抗貿(mào)易有限公司；β-actin 抗體和兔二抗購自Cell Signaling Technology；免疫組化試劑盒、蛋白上樣Marker購自美國 Thermo Fisher 公司；DAB 顯色試劑盒、BCA 蛋白定量試劑盒購自陜西中暉赫彩生物醫(yī)藥科技有限公司；青鏈霉素混合液、Annexin V-FITC/PI 細胞凋亡檢測試劑盒、乳酸檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；XF測定培養(yǎng)基購自Seahorse Bioscience公司；24孔海馬測定板購自安捷倫科技公司。

二、研究方法

(一)免疫組化檢測癌組織與癌旁組織中ACSL1的表達 病理切片60 ℃恒溫箱烤片20 min；二甲苯浸泡脫蠟；無水乙醇和3種由高到低濃度酒精依次浸泡水化；自來水沖洗；檸檬酸鈉緩沖液抗原修復(fù)；PBS洗滌；H2O2水封閉內(nèi)源性過氧化物酶；PBS洗滌；山羊血清阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；ACSL1 抗體(1∶50)孵育，4 ℃過夜；PBS洗滌；生物素標(biāo)記山羊抗兔IgG靜置孵育15 min；PBS洗滌；辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液孵育20 min；PBS洗滌；鏡下DAB顯色觀察；蘇木精復(fù)染；自來水沖洗；1%鹽酸酒精分化；自來水返藍；酒精和無水乙醇依次浸泡脫水；二甲苯浸泡透明；中性樹膠封片；鏡下觀察：細胞染色強度判斷：陰性0分，弱陽性1分，陽性2分，強陽性3分；細胞陽性率判斷：<10%為0分，10%～30%為1分，31%～60%為2分，>60%為3分；細胞染色強度和陽性率的乘積為免疫結(jié)果，總分<2分為低表達，≥2分為高表達。

(二)細胞培養(yǎng)和慢病毒轉(zhuǎn)染 配置含10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素混合液的RPMI培養(yǎng)基，用于孵育SNU739細胞。把對數(shù)生長期的細胞用Trypsin-EDTA消化；細胞計數(shù)；6孔板種植轉(zhuǎn)染(4×105/孔)：對照組(control)轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒慢病毒，實驗組轉(zhuǎn)染ACSL1過表達慢病毒；待細胞長到50%時轉(zhuǎn)染慢病毒：948 μL常規(guī)RPMI培養(yǎng)基 +40 μL感染增強P液 +12 μL病毒液(病毒濃度為 108/mL)；8 h后更換培養(yǎng)基；72 h后用1 μg/mL嘌呤霉素進行抗嘌呤霉素細胞篩選，將其傳代培養(yǎng)。

(三)Western blot檢測SNU739癌細胞ACSL1的表達 提取實驗組和對照組細胞總蛋白；BCA法檢測樣本蛋白濃度；5×蛋白上樣緩沖液使蛋白變性；取35 μg蛋白上樣，10%SDS-PAGE電泳；250 mA、90 min恒流將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；10%脫脂奶粉室溫?fù)u床封閉 3 h；ACSL1 抗體(1∶1 000)4 ℃孵育過夜；1×PBST 洗膜3次；二抗室溫孵育1 h；PBST 再次洗滌3次；HRP-ECL化學(xué)發(fā)光液顯影。

(四)MTS法檢測ACSL1對SNU739細胞增殖能力的影響 取實驗組和對照組對數(shù)生長期癌細胞，Trypsin-EDTA消化；細胞計數(shù)使細胞懸液濃度為 2×104個/ mL，加入96孔板，100 μL/孔；37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育過夜，鏡下觀察；每孔加入20 μL的MTS(5 mg/mL)，孵育1 h；酶標(biāo)儀490 nm 波長處檢測細胞吸光度值，記錄為起始值；同樣的方法分別在24、48、72、96 h檢測吸光度值。每組采用5個復(fù)孔，實驗重復(fù) 3 次，記錄數(shù)據(jù)并繪制細胞增殖曲線。

(五)流式細胞儀檢測ACSL1對SNU739細胞凋亡的影響 取實驗組和對照組對數(shù)生長期癌細胞，Trypsin-EDTA消化；細胞計數(shù)使細胞懸液濃度約為1×106個/mL；1 000 r/min，4 ℃離心10 min后收集細胞，棄培養(yǎng)基；用冷PBS 輕輕震蕩使細胞懸浮，1 000 r/min， 4 ℃離心10 min后收集細胞，該步驟重復(fù)2次；200 μL 1×Binding Buffer 緩沖液懸浮細胞；向上述細胞懸液中加入10 μL Annexin V-FITC輕輕混勻，4 ℃避光孵育30 min；加入20 μL PI輕輕混勻，4 ℃避光孵育15 min；1 h內(nèi)用流式細胞儀檢測。

(六)Seahorse XF24分析儀檢測ACSL1對SNU739細胞OCR的影響 Seahorse XF24分析儀檢測前一天，在探針板中加入校正液后，放入37 ℃、無CO2的培養(yǎng)箱過夜進行活化；實驗組和對照組的癌細胞以5×104個/孔接種到24孔板中，在37 ℃、CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜；第二天，細胞培養(yǎng)板從培養(yǎng)箱中取出，記錄時間，用XF測定培養(yǎng)基替換原來的培養(yǎng)基，將細胞板置于37 ℃無CO2的培養(yǎng)箱中1 h；正式測定前，進行預(yù)測試以發(fā)現(xiàn)每種抑制劑的最佳濃度：寡霉素(oligomycin)3 μmol/L，三氟甲氧基羰基氰化物苯腙(FCCP)1 μmol/L，魚藤酮(ROT)4 μmol/L，抗霉素A 4 μmol/L；XF24細胞外通量分析儀上測量OCR，XF Cell Mito Stress Test Generator軟件分析整理數(shù)據(jù)結(jié)果。

(七)乳酸試劑盒檢測ACSL1對SNU739細胞乳酸的影響 實驗組和對照組的癌細胞Trypsin-EDTA消化；PBS重懸，1 000 r/min，離心10 min，棄上清，留細胞沉淀；加入PBS緩沖液清洗1～2次，同樣1 000 r/min，離心10 min，棄上清液，留細胞沉淀；加入1%～2%的TritonX-100細胞裂解液0.2～0.3 mL, 4 ℃條件下裂解30～40 min，裂解好的液體不離心直接進行測定；取96孔板和乳酸試劑盒，將裂解液和測試試劑于EP管內(nèi)混合，移入到96孔板；酶標(biāo)儀在波長510 nm測定吸光度值，計算各組細胞內(nèi)乳酸含量。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

數(shù)據(jù)整理后，用SPSS 26.0和Graph Pad Prism 8.0進行統(tǒng)計學(xué)分析。計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗；計數(shù)資料分析用χ2檢驗；生存分析用Cox 比例風(fēng)險回歸。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、ACSL1在HCC癌組織及癌旁組織中的表達及癌組織中ACSL1與HCC患者臨床病理特征關(guān)系

免疫組化檢測顯示，癌組織中ACSL1染色大多為弱陽性，而癌旁組織中大多為陽性至強陽性。癌組織及癌旁組織中 ACSL1 的免疫組化結(jié)果分別為3.02±2.57和7.60±3.34,癌組織的ACSL1表達顯著低于癌旁組織(t=20.040,P=0.000),見圖1。通過6年的隨訪資料，發(fā)現(xiàn)HCC中ACSL1表達與不同年齡存在相關(guān)性(P<0.000)，而與性別(P>0.05)、臨床分期(P>0.05)均無關(guān)，見表1。

圖1 HCC癌組織及癌旁組織ACSL1的表達

表1 ACSL1蛋白表達與HCC臨床病理特征關(guān)系

二、HCC預(yù)后單因素和多因素Cox分析

首先將已知的可能影響HCC預(yù)后的臨床資料進行Cox單因素分析，發(fā)現(xiàn)ACSL1蛋白表達、TNM分期與HCC的預(yù)后有相關(guān)性(均P<0.1)，而性別、年齡與預(yù)后無關(guān)(均P>0.5)；再將與HCC預(yù)后相關(guān)的因素作為自變量進行多因素Cox回歸分析，發(fā)現(xiàn)ACSL1蛋白表達水平是HCC患者生存的危險因素(HR=1.642,P=0.012)，見表2。

表2 肝細胞癌患者預(yù)后單因素及多因素Cox分析

三、ACSL1對SNU739細胞增殖和凋亡的影響

Western blot驗證實驗組和對照組ACSL1蛋白表達，發(fā)現(xiàn)實驗組ACSL1蛋白表達水平明顯高于對照組，見圖2A；MTS法檢測ACSL1對SNU739細胞增殖的影響，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞增殖能力較對照組細胞顯著減弱(F=45.056 ，P=0.003)，見圖2B；Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測ACSL1對SNU739細胞凋亡影響，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞凋亡百分?jǐn)?shù)顯著高于對照組(t=13.886，P=0.000)，見圖2C、2D。

A.Western blot驗證SNU739細胞過表達ACSL1；B.MTS法檢測ACSL1對HCC細胞增殖的影響；C.Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測實驗組ACSL1對HCC細胞凋亡的影響；D. Annexin V-FITC/PI雙染法流式檢測對照組ACSLI對HCC細胞凋亡的影響

四、ACSL1對SNU739細胞能量代謝的影響

Seahorse XF24分析儀檢測實驗組和對照組細胞線粒體OCR，發(fā)現(xiàn)在加入FCCP后，隨著時間進展，實驗組細胞基礎(chǔ)氧耗速率(F=83.429,P=0.001)、最大氧耗速率(F=859.792,P=0.000)明顯高于對照組，解偶聯(lián)呼吸較對照組增強(F=11.579,P=0.027)，見圖3；乳酸試劑盒檢測實驗組和對照組細胞乳酸含量，發(fā)現(xiàn)實驗組細胞乳酸含量低于對照組的(t=4.585，P=0.010)。

圖3 Seahorse XF24分析儀檢測ACSL1對HCC OCR的影響

討 論

HCC是由感染以及與慢性壞死性炎癥相關(guān)代謝物和毒物誘發(fā)的癌癥范例。盡管這些發(fā)現(xiàn)已轉(zhuǎn)為一級和二級預(yù)防措施，以及疾病的模型系統(tǒng)，但臨床上特征明顯的HCC預(yù)后仍然很差[1,12]。因此,發(fā)現(xiàn)新的HCC預(yù)后標(biāo)志物，將更有利于改善HCC患者的預(yù)后。生理條件下，ACSL1以ATP依賴的方式將特定的游離長鏈脂肪酸活化為脂酰輔酶A，作為代謝變阻劑調(diào)節(jié)肝臟[13]、心臟[14]、骨骼肌[15]和脂肪組織[16]的脂質(zhì)代謝。研究表明，當(dāng)肝臟中ACSL1表達異常時，可使肝臟的脂質(zhì)代謝失調(diào)，導(dǎo)致肝臟功能異常，甚至發(fā)生肝惡變[17-18]。本研究旨在探討ACSL1在HCC中的表達及對HCC預(yù)后、HCC細胞株SNU739增殖和凋亡的影響，并且初步探究ACSL1在HCC中的作用機制。

Cui等[10]在探究肝癌中特異性過度表達的lncRNA(Highly upregulated in liver cancer ，HULC)對HCC脂質(zhì)代謝紊亂的作用時，發(fā)現(xiàn)ACSL1可被HULC顯著上調(diào)，并且免疫組化檢測ACSL1在臨床HCC組織樣本的表達，發(fā)現(xiàn)ACSL1在HCC癌組織中的表達強于癌旁組織。Muir等[11]報道，在磷酸酶和張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog，Pten)誘導(dǎo)的小鼠HCC和小鼠非酒精性脂肪性肝炎(Non-alcoholic steatohepatitis，NASH)模型中，對小鼠HCC組織和NASH組織進行廣泛質(zhì)譜分析，發(fā)現(xiàn)Pten缺失的HCC中，ACSL1 mRNA的表達明顯下調(diào)，并且與癌旁NASH組織相比，ASCL1在腫瘤組織中的表達也顯著降低。本研究通過免疫組化分析334例HCC患者癌組織及癌旁正常組織中ACSL1表達情況，發(fā)現(xiàn)癌組織中ACSL1的表達要較癌旁組織低；進一步分析HCC中ACSL1表達與HCC臨床病理特征關(guān)系，發(fā)現(xiàn)ACSL1的表達與HCC患者的年齡和臨床分期顯著相關(guān)，與其他臨床病理無相關(guān)；在 HCC預(yù)后單因素和多因素Cox分析中,發(fā)現(xiàn)ACSL1低表達的HCC患者預(yù)后更差，ACSL1蛋白表達水平是HCC患者生存的危險因素。

Guo等[6]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺癌中小核仁RNA宿主基因7表達上調(diào)，可降低miR-449a表達，進而上調(diào)ACSL1促進癌細胞增殖和遷移，抑制癌細胞凋亡。Chen等為了驗證ACSL1對大腸癌的致癌作用和對肺癌的抑制作用，將兩種表達ACSL1 shRNA的慢病毒顆粒分別導(dǎo)入大腸癌HCT116細胞和肺A549細胞中，發(fā)現(xiàn)ACSL1 shRNA抑制HCT116細胞的增殖，但促進A549細胞的增殖[19]。本研究在慢病毒構(gòu)建的ACSL1過表達SNU739細胞中，發(fā)現(xiàn)ACSL1可減弱SNU739細胞增殖能力，而顯著促進其凋亡，說明ACSL1在HCC的進展中可能介導(dǎo)一種特定機制。

Cassim等證實HCC表現(xiàn)出普遍的糖酵解代謝，但在葡萄糖缺乏的情況下，脂肪酸氧化(fatty acid oxidation，F(xiàn)AO)被激活，可以為癌細胞供應(yīng)能量并促進增殖[20]。 Sangineto等[8]報道，癌細胞中FAO被激活后，電子傳輸鏈的過度活性可能產(chǎn)生活性氧和氧化損傷，導(dǎo)致癌細胞死亡。而在缺氧誘導(dǎo)因子-1α介導(dǎo)的FAO抑制，有利于肝癌細胞對低氧環(huán)境的適應(yīng)，但是在常氧條件下增強的FAO對肝癌的生長沒有影響[21-22]?？梢?，F(xiàn)AO在HCC進展中的作用和HCC所處的背景有很大的相關(guān)性，需要更廣泛的研究來了解癌癥代謝重新編程對FAO的影響。線粒體是細胞的能量加工廠，產(chǎn)生的 ATP為機體的基本生命活動提供能量。本研究通過檢測實驗組細胞和對照組細胞的線粒體OCR和乳酸含量，初步探究ACSL1對HCC能量代謝的影響，結(jié)果表明實驗組細胞線粒體OCR明顯高于對照組，而乳酸含量明顯低于對照組。提示與對照組細胞的糖酵解供能相比，ACSL1過表達的肝癌細胞能量供應(yīng)主要來源線粒體的三羧酸循環(huán)。

本研究的不足之處是未能進一步明確ACSL1異常表達對HCC能量代謝重編程的具體機制。但結(jié)合前文描述，我們推測，ACSL1可能通過FAO途徑參與線粒體三羧酸循環(huán)，進而參與HCC的發(fā)生、發(fā)展。下一步我們將結(jié)合動物實驗，進一步深入探討ACSL1在HCC中的具體機制，并且借ACSL1相關(guān)研究進一步揭示FAO異常在HCC參與的新途徑。