乳腺癌HER2蛋白陽(yáng)性表達(dá)的基因狀態(tài)及其與P53蛋白相關(guān)性研究

[摘要]目的 研究乳腺癌HER2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的基因狀態(tài)及其與P53蛋白相關(guān)性，探討其與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在關(guān)系。方法 選取257例HER2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的浸潤(rùn)性乳腺癌樣本，分別應(yīng)用熒光原位雜交（FISH）法和免疫組織化學(xué)EliVisionTMplus法對(duì)標(biāo)本中的HER2基因和P53蛋白、ER和PR受體進(jìn)行檢測(cè)并做相關(guān)性分析。 結(jié)果 ①HER2基因擴(kuò)增率64.59%（166/257）；其中IHC（2+）56.48%（109/193），（3+）89.06%（57/64）；HER2基因擴(kuò)增和其蛋白陽(yáng)性表達(dá)比較有顯著相關(guān)性（P < 0.01）。②P53蛋白表達(dá)率52.92%（136/257），P53蛋白表達(dá)率、HER2基因擴(kuò)增率與ER、PR受體表達(dá)及腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移差異有顯著性（P < 0.05）；與腫瘤大小、病理學(xué)類型、年齡無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。 結(jié)論 HER2基因擴(kuò)增率與P53蛋白表達(dá)率呈正相關(guān)，兩者指標(biāo)的聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌的轉(zhuǎn)移、預(yù)后評(píng)估具有重要的參考意義。

[關(guān)鍵詞] 乳腺腫瘤；HER2；P53蛋白；免疫組織化學(xué)；熒光原位雜交

[中圖分類號(hào)] R737.9 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）33-0113-03

隨著科研的發(fā)展，分子生物學(xué)指標(biāo)作為癌癥發(fā)展、治療及預(yù)后評(píng)估的價(jià)值取得了長(zhǎng)足發(fā)展，受到越來(lái)越多的國(guó)內(nèi)外學(xué)者高度重視。HER2基因位于人17號(hào)染色體長(zhǎng)臂21位，編碼一種與人表皮生長(zhǎng)因子受體高度同源的酪氨酸激酶受體，在乳腺癌的侵襲、治療、預(yù)后評(píng)估中起著重要作用。選取我院257例HER2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的浸潤(rùn)性乳腺癌手術(shù)切除標(biāo)本，采用熒光原位雜交（FISH）法檢測(cè)標(biāo)本中的HER2基因擴(kuò)增狀態(tài)，探討其與P53蛋白表達(dá)及臨床預(yù)后因素的關(guān)系。

1資料與方法

1.1病例資料

收集我院病理科2010年10月～2013年6月外檢手術(shù)切除浸潤(rùn)性乳腺癌根治病例，篩選出257例HER2蛋白陽(yáng)性表達(dá)標(biāo)本，其中HER2蛋白（2+）193例，（3+）64例，患者均為女性，年齡26～79歲，平均51歲。病理類型包括浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌224例，伴髓樣特征的浸潤(rùn)性癌15例，浸潤(rùn)性微乳頭狀癌10例，大汗腺癌8例。

1.2 免疫組織化學(xué)檢測(cè)（IHC）

采用EliVisionTMplus法染色，所用HER2蛋白、雌激素受體（ER）、孕激素受體（PR）和P53蛋白抗體試劑盒均采購(gòu)自福建邁新公司。手術(shù)切除標(biāo)本均10%中性福爾馬林固定，經(jīng)脫水石蠟包埋，4μm連續(xù)切片，于65℃烤箱烤片2h，脫蠟、水化，檸檬酸鹽高壓修復(fù)，按照試劑盒操作說(shuō)明書步驟嚴(yán)格執(zhí)行。實(shí)驗(yàn)以預(yù)知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照，PBS替代一抗為陰性對(duì)照。結(jié)果判定：HER2判讀標(biāo)準(zhǔn) 0：全部癌細(xì)胞中細(xì)胞膜無(wú)著色者；1+：任何比例癌細(xì)胞呈現(xiàn)微弱或不完整的細(xì)胞膜著色者；2+：>10%癌細(xì)胞呈現(xiàn)輕-中度、完整但不均勻的細(xì)胞膜著色或<30%癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜著色者；3+：≥30%癌細(xì)胞呈現(xiàn)強(qiáng)而完整的細(xì)胞膜著色者。ER、PR和P53判讀標(biāo)準(zhǔn)：陽(yáng)性著色部位均為癌細(xì)胞核。癌細(xì)胞總數(shù)<5%著色為0；5%～25%著色為1+；26%～50%著色為2+，50%以上著色為3+。

1.3 熒光原位雜交（FISH）

HER2基因探針試劑盒及蛋白酶購(gòu)自北京金菩嘉醫(yī)療科技有限公司。方法：取上述4μm切片60℃烤片過(guò)夜，脫蠟、梯度水化，于蒸餾水煮沸30min，37℃蛋白酶消化，滴加探針后83℃變性5min，42℃雜交過(guò)夜，洗滌干燥，DAPI復(fù)染，熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果判讀：HER2基因信號(hào)顯示為橘紅色，17號(hào)染色體著絲粒信號(hào)顯示為綠色，計(jì)數(shù)30個(gè)癌細(xì)胞，分別統(tǒng)計(jì)橘紅色信號(hào)與綠色信號(hào)總數(shù)值，然后計(jì)算其比值。比值<1.8者歸入陰性，視為無(wú)基因擴(kuò)增；比值>2.2或眾多橘紅色信號(hào)成簇分布者歸入陽(yáng)性，視為基因擴(kuò)增；比值1.8～2.2 者，擴(kuò)大癌細(xì)胞計(jì)數(shù)到100個(gè)或重新檢測(cè)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。采用非參數(shù)檢驗(yàn)判斷HER2基因擴(kuò)增與蛋白表達(dá)狀況及與年齡、腫瘤大小、病理學(xué)類型、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和ER、PR表達(dá)的相互關(guān)系；以P < 0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌HER2基因擴(kuò)增和HER2蛋白表達(dá)的關(guān)系

本組257例浸潤(rùn)性乳腺癌，HER2基因擴(kuò)增（圖1）率64.59%，分別為HER2蛋白（2+）（圖2）193例，HER2基因擴(kuò)增109例，占比56.46%。HER2蛋白（3+）（圖3）64例，HER2基因擴(kuò)增57例，占比89.06%。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，比較HER2基因擴(kuò)增與HER2蛋白不同強(qiáng)度的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.01）。見表1及圖1～4。

2.2 HER2基因擴(kuò)增與P53蛋白表達(dá)及預(yù)后因素的關(guān)系

HER2基因擴(kuò)增和P53蛋白表達(dá)（圖4）與乳腺癌患者發(fā)病年齡、腫瘤大小、病理學(xué)類型無(wú)關(guān)（P > 0.05）。HER2基因擴(kuò)增和P53蛋白表達(dá)與患者腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、ER和PR受體表達(dá)差異有顯著性（P < 0.05）。見表 2 。

3 討論

乳腺癌是嚴(yán)重危害女性健康與生命的常見惡性腫瘤之一[1]，多種發(fā)病機(jī)制中，20%～30%的患者與HER2蛋白過(guò)表達(dá)或基因 擴(kuò)增有關(guān)，并且HER2狀態(tài)還是靶向曲妥珠單抗藥物治療有無(wú)反應(yīng)的關(guān)鍵指標(biāo)，所以準(zhǔn)確的HER2檢測(cè)結(jié)果非常重要[2]。檢測(cè)HER2狀態(tài)的方法主要有免疫組織化學(xué)（HC）和熒光原位雜交（FISH）。IHC檢測(cè)HER2蛋白，目前臨床上開展最為普遍，它具有操作過(guò)程容易掌握、實(shí)驗(yàn)成本低等優(yōu)點(diǎn)，但是其結(jié)果容易受到組織固定、技術(shù)操作、切片判讀等多種環(huán)節(jié)的影響。FISH檢測(cè)HER2基因擴(kuò)增，其結(jié)果穩(wěn)定、可靠，受影響小，成本較高，被認(rèn)為是目前最準(zhǔn)確、可重復(fù)性最高的方法[3]。

本研究結(jié)果顯示，HER2結(jié)果IHC2+中FISH陽(yáng)性率56.48%，與國(guó)外學(xué)者的研究數(shù)據(jù)有差異[4，5]。HER2結(jié)果IHC3+中FISH陽(yáng)性率89.06%，與國(guó)外學(xué)者研究數(shù)據(jù)相近。多數(shù)情況下，HER2蛋白過(guò)表達(dá)與DNA擴(kuò)增同時(shí)發(fā)生，但由于腫瘤細(xì)胞17號(hào)染色體多體[6]或因IHC蛋白檢測(cè)過(guò)程容易受到多種外在環(huán)節(jié)影響等原因，常出現(xiàn)HER2蛋白過(guò)表達(dá)與FISH檢測(cè)結(jié)果不一致的情況，因此我們建議，HER2蛋白陽(yáng)性病人均應(yīng)進(jìn)行FISH檢測(cè)，明確基因狀態(tài)。本研究中HER2蛋白2+的FISH陽(yáng)性率偏高于國(guó)外學(xué)者數(shù)據(jù)，可能與樣本量小、地域人群差異或?qū)η衅凶x標(biāo)準(zhǔn)把握不同有關(guān)。

P53基因分為野生型和突變型。編碼正常的P53基因（野生型）是與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展高度相關(guān)的抑癌基因，正常組織中一般不表達(dá)。突變型P53基因失去野生型P53基因的生物活性，不能修復(fù)細(xì)胞受損DNA，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生癌變[7]，應(yīng)用IHC方法只能檢測(cè)突變型P53蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果表明，在ER、PR受體陰性組及發(fā)生腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中，HER2基因擴(kuò)增與P53蛋白表達(dá)明顯高于ER、PR受體陽(yáng)性組及腋窩淋巴結(jié)無(wú)轉(zhuǎn)移組（P < 0.05），顯示HER2基因擴(kuò)增和P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)。同時(shí)本研究也表明兩者與患者年齡、腫瘤大小、病理學(xué)類型無(wú)相關(guān)性（P > 0.05）。本研究結(jié)果中，同時(shí)具有HER2基因擴(kuò)增和P53蛋白表達(dá)者，更多發(fā)生高陰性激素受體狀態(tài)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況，揭示患者預(yù)后不良。乳腺癌的發(fā)生、進(jìn)展機(jī)制不明，其過(guò)程可能是多種癌基因、抑癌基因相互作用、影響的結(jié)果，而兩者在其中是否起到某種共同參與協(xié)同作用有待更深入研究。

綜上所述，HER2蛋白陽(yáng)性患者均應(yīng)進(jìn)行HER2基因檢測(cè)，HER2基因擴(kuò)增與P53蛋白表達(dá)呈正相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)乳腺癌轉(zhuǎn)移、預(yù)后評(píng)估具有重要參考意義。

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（收稿日期：2013-08-14）