50例胃腸道間質(zhì)瘤患者c—kit及PDGFR—a基因檢測及突變分析

[摘要] 目的 研究分析胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）中c-kit基因及PDGFRα基因突變特點(diǎn)與規(guī)律。 方法 用PCR擴(kuò)增和基因測序的方法檢測50例胃腸道間質(zhì)瘤組織中c-kit基因第9、11、13外顯子和PDGFRΑ基因第12、18外顯子的序列。 結(jié)果 在50例成功檢測序列的GIST中共檢測到c-kit基因突變32例， PDGFRα基因的突變共檢測到2例。 結(jié)論 ①大部分的GIST存在c-kit基因的突變，在無c-kit基因突變的GIST中有一部分存在PDGFRα基因的突變。②c-kit基因突變主要集中在第11號(hào)外顯子。突變的方式頻率由高到低依次為點(diǎn)突變、缺失突變和串聯(lián)重復(fù)插入。③胃GIST中c-kit exon11 突變率較小腸、結(jié)直腸及胃腸道外GIST的突變率高。

[關(guān)鍵詞] 胃腸道間質(zhì)瘤；c-kit基因；PDGFR-α基因；基因突變

[中圖分類號(hào)] R735.2 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）23-0054-03

胃腸道間質(zhì)瘤（gastrointestinal stromal tumors，GISTs）是胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，約占全部胃腸道腫瘤的1%～2%，發(fā)病率有不斷升高的趨勢。21世紀(jì)90年代以來，隨著Maeda[1]，Huizinga， kindblom， Hirota[2]，Heinrich等為代表的學(xué)者們的不懈努力，現(xiàn)已基本闡明其發(fā)病機(jī)制，GIST中存在c-kit基因功能獲得性突變或血小板衍生生長因子受體α （PDGFRα）的基因功能獲得性突變，走出了長期以來對(duì)該病的認(rèn)識(shí)誤區(qū)。本文我們收集了深圳市第二人民醫(yī)院及湘雅醫(yī)院近幾年的胃腸道間質(zhì)瘤患者手術(shù)后腫瘤組織進(jìn)行基因擴(kuò)增和直接測序的方法檢測腫瘤c-kit基因9、11、13號(hào)外顯子及PDGFRα基因12、18號(hào)外顯子的突變情況，分析并揭示胃腸道間質(zhì)瘤基因突變特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料

選取深圳市第二人民醫(yī)院和湘雅醫(yī)院2008年8月～2012年6月收治的、經(jīng)手術(shù)與病理組織學(xué)及免疫組化證實(shí)的、資料完整的胃腸道間質(zhì)瘤病例62例，收集術(shù)后腫瘤組織或切片進(jìn)行基因檢測。所有患者術(shù)前均未接受化療、放療、免疫治療及其他針對(duì)腫瘤的治療。本組成功檢測基因序列50例，12例因未能成功提取基因組DNA予以剔除。

1.2石蠟組織或新鮮腫瘤組織基因組DNA抽提

采用組織/細(xì)胞基因組DNA快速提取試劑盒（廣州東盛生物科技有限公司）。見圖1。引物合成，查閱文獻(xiàn)[3]，根據(jù)KIT及PDGFRα基因序列（表1），由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，紫外燈下檢測擴(kuò)增片段檢測（圖2）。挑選條帶明晰的樣品送測序。

1.3 突變分析

測序結(jié)果與NCBI基因庫中c-kit和PDGFRα基因序列進(jìn)行比對(duì)（網(wǎng)址：http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/index.html）。

2 結(jié)果

2.1基因突變與GIST發(fā)生部位的分析

本組50例GIST，腫瘤原發(fā)于胃27例，小腸15例，結(jié)直腸6例，胃腸道外（包括腹膜、盆腔）2例。通過SPSS分析發(fā)現(xiàn)由于原發(fā)于結(jié)直腸及胃腸道外的病例數(shù)較少，單獨(dú)分為兩組無法進(jìn)行可信的卡方檢驗(yàn)，獲得可信的結(jié)論，因此將結(jié)直腸及胃腸道外歸為一組進(jìn)行分析。原發(fā)部位與總突變率及c-kit 11外顯子突變率之間關(guān)系（表2），從表2中可見，基因突變發(fā)生率在不同的部位有差異。隨后進(jìn)行兩兩比較發(fā)現(xiàn)，原發(fā)于胃組的基因總突變率及c-kit外顯子11突變率均較其他部位高，差異具有顯著性（χ2=5.061，P = 0.024； χ2=7.346， P = 0.007）；（χ2=4.20，P = 0.04； χ2=8.75，P = 0.013）。

2.2腫瘤大小與基因突變

不同腫瘤大小與總突變率及ckit外顯子11突變率的關(guān)系見表3，經(jīng)分析檢驗(yàn)，基因總突變率以及c-kit外顯子11突變率在不同腫瘤大小間沒有差異（χ2=0.079， P =0.961； χ2=0.019， P = 0.991）， 隨后根據(jù)外顯子11不同突變形式分組，比較不同突變形式在不同腫瘤大小間是否有差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)三者無顯著性差異（χ2=0.177，P = 0.915； χ2=0.059，P = 0.971； χ2=0.829，P = 0.661）。

3 討論

本組本組50例胃腸道間質(zhì)瘤中共檢測到c-kit基因突變32例，其中11號(hào)外顯子突變30例，占c-kit突變病例的93.8%；9號(hào)外顯子突變1例，占2.94%，13號(hào)外顯子突變1例。存在c-kit突變的GIST均有KIT蛋白的表達(dá)即CD117均為陽性，占全部CD117陽性病例的69.56%（32/46），PDGFRα基因突變2例。通過分析我們可以發(fā)現(xiàn)基因突變?nèi)缦绿攸c(diǎn)。

3.1 大多數(shù)的GIST中存在c-kit基因突變

我們檢測50例GIST中檢測到c-kit突變32例，突變率64%，與文獻(xiàn)報(bào)道突變率19.6%～92%[4-6]相近。c-kit基因突變以編碼胞內(nèi)近膜區(qū)的11外顯子常見（圖3、圖4），9號(hào)外顯子相對(duì)較少，本研究發(fā)現(xiàn)1例雜合性突變（圖5）。檢出11外顯子突變30例，突變率60% ，與文獻(xiàn)報(bào)道的52%～66%的突變率相近[7，8]。c-kit基因突變有集中趨勢， 11號(hào)外顯子的突變多集中于第550-560和第570-580密碼子。突變的方式有缺失突變、點(diǎn)突變和插入重復(fù)突變。

3.2 部分沒有c-kit突變的GIST中檢測到PDGFRα基因突變

以18外顯子的突變常見，本組中共檢測到2例PDGFRα基因突變， 18外顯子的突變1例， 12外顯子突變1例，均發(fā)生于胃，與PDGFRα基因的突變與c-kit基因突變相互獨(dú)立報(bào)道[9]相符，PDGFRα基因的突變?yōu)镚IST發(fā)病機(jī)制之一。

3.3關(guān)于c-kit基因外顯子9突變特點(diǎn)

文獻(xiàn)報(bào)道[10，11]主要表現(xiàn)為編碼丙氨酸（Ala）和酪氨酸（Tyr）的第502和503個(gè)密碼子的6個(gè)核苷酸（GCCTAT）的串聯(lián)插入重復(fù)，以小腸GIST多見。我們檢測到1例9號(hào)外顯子突變，符合以上特點(diǎn)。

3.4 PDGFRα基因外顯子12的點(diǎn)突變，未見文獻(xiàn)報(bào)道

第566位密碼子AGC突變?yōu)锳TC，其編碼的絲氨酸（Ger）突變?yōu)楫惲涟彼幔↖le）。可能是新的突變點(diǎn)，見圖6。

3.5 50例標(biāo)本中有16例GIST未檢測到c-kit基因或PDGFRα基因的突變

提示在部分野生型GIST中可能存在其他的發(fā)病機(jī)制，或少見位點(diǎn)的突變。

4 結(jié)論

①大多數(shù)的GIST存在c-kit基因的突變，無c-kit基因突變的GIST中有一部分存在PDGFRα基因的突變。②c-kit基因突變主要集中在第11號(hào)外顯子，其次為第9外顯子。突變的方式依次為缺失、點(diǎn)突變和串聯(lián)重復(fù)插入。PDGFRα基因的突變主要存在于CD117陰性的GIST。③結(jié)直腸以及胃腸道外及小腸GIST的總突變率較胃GIST為低；胃GIST的c-kit外顯子11突變率也較其他部位GIST高。

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（收稿日期：2013-06-13）