色素上皮衍生因子對小鼠腎透明細(xì)胞癌模型的抑制研究

[摘要] 目的 研究重組人色素上皮衍生因子（rPEDF）在體內(nèi)抑制腎透明細(xì)胞癌組織血管生成從而抑制腫瘤生長。方法 腎透明細(xì)胞癌細(xì)胞株786-0以濃度為5×106/100 μL在裸鼠左腋部背側(cè)皮下注射，建立皮下移植瘤模型，分為兩組（每組6只）：對照組（藥物用PBS代替），1 μg/200 μL rPEDF治療組，每日1次，連續(xù)注射2周。測量腫瘤大小，腫瘤組織行HE染色和免疫組織化學(xué)方法檢測CD34標(biāo)記的微血管。 結(jié)果 PBS對照組與rPEDF治療組移植瘤平均體積分別為（1672.23±65.28）mm3和（1202.44±56.34）mm3，抑瘤率為28%，兩組比較差異有顯著性（P = 0.034）。PBS對照組與rPEDF治療組小鼠移植腎透明細(xì)胞癌組織中微血管密度（MVD）平均為（72.83±12.34）和（25.67±8.56）/高倍鏡視野，治療組小鼠移植腎透明細(xì)胞癌組織中MVD減少65%，兩組比較差異具有顯著性（P = 0.006）。 結(jié)論 rPEDF治療組小鼠移植瘤微血管密度明顯減低，移植瘤的體積也相應(yīng)減低，提示rPEDF能抑制血管新生，減緩腎透明細(xì)胞癌生長。

[關(guān)鍵詞] 腎癌；裸鼠；色素上皮衍生因子；血管生成

[中圖分類號] R737 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）23-0010-02

腫瘤的生長依賴腫瘤血管的生成，抑制腫瘤血管的生成，能切斷腫瘤生長的營養(yǎng)供應(yīng)途徑，阻斷腫瘤血運(yùn)侵襲轉(zhuǎn)移途徑，從而有效遏制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移，是治療腫瘤的有效方法。PEDF能抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖和遷移，抑制血管管狀形成；體內(nèi)移植瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PEDF有效抑制新生血管的形成，并能抑制腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移。在前期研究工作中，我們發(fā)現(xiàn)腎透明細(xì)胞癌組織PEDF的表達(dá)與腫瘤微血管密度成反比[1]，是否應(yīng)用重組人色素上皮衍生因子（rPEDF）在體內(nèi)抑制腎透明細(xì)胞癌組織血管生成，導(dǎo)致腫瘤萎縮？在前期的研究結(jié)果基礎(chǔ)之上，我們采用皮下接種的方法建立裸鼠的腎透明細(xì)胞癌模型，經(jīng)過rPEDF的治療，測定兩種方法的抑瘤率，采用免疫組化方法檢測腎透明細(xì)胞癌模型微血管密度的變化，從而判定rPEDF對腎透明細(xì)胞癌血管生成及腫瘤生長的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及分組處理

1.2 腫瘤微血管密度計數(shù)

MVD 檢測方法按Weidner[2]等法，CD34定位于血管內(nèi)皮細(xì)胞胞漿，呈棕黃色。先在低倍鏡（4×10）下觀察整個切片，選取血管內(nèi)皮細(xì)胞染色清晰，背景對比良好、微血管數(shù)量最密集的視野，再在高倍鏡（20×10）下觀察每單位面積（0.723 mm2）組織內(nèi)CD34單克隆抗體標(biāo)記的微血管（MV）數(shù)。結(jié)果以5個高倍（20×10）視野MV數(shù)的均數(shù)表示。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS15.0軟件進(jìn)行分析，腫瘤體積和微血管密度均為連續(xù)計量資料，采用t檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組裸鼠腫瘤體積情況

所有裸鼠移植瘤的發(fā)生率為100%，兩組小鼠移植瘤均經(jīng)HE染色確認(rèn)為透明細(xì)胞癌，在整個實(shí)驗(yàn)過程中無裸鼠死亡，經(jīng)注射rPEDF和PBS后，完成兩周治療后第4天，PBS對照組與rPEDF治療組移植瘤平均體積分別為（1 672.23± 65.28）mm3和（1 202.44±56.34）mm3，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（t = 2.467，P = 0.034），抑瘤率為28%。

2.2 免疫組化檢測腫瘤微血管密度

兩組小鼠移植瘤組織中均可見CD34標(biāo)記的微血管，提示移植瘤組織中有大量新生血管的存在，微血管呈網(wǎng)狀、管狀散在或彌漫分布，血管形態(tài)差異性較大。PBS對照組與rPEDF治療組小鼠移植瘤組織中MVD平均分別為（72.83±12.34）和（25.67±8.56）/高倍鏡視野，兩組比較差異具有顯著性（t = 3.421，P = 0.006），rPEDF治療組小鼠移植腎透明細(xì)胞癌組織中MVD減少65%。

3 討論

外科手術(shù)是治療腎透明細(xì)胞癌唯一有效的方法，但僅局限早期腎癌，有30%的患者可出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移，因腎透明細(xì)胞癌中有多種耐藥蛋白過度表達(dá)，常規(guī)化療收效甚微，已經(jīng)發(fā)生腎癌轉(zhuǎn)移的患者5年生存率仍然非常低，中位生存期只有12個月。非特異性免疫治療白細(xì)胞介素-2（IL-2） 或干擾素α或聯(lián)合化療雖被公認(rèn)是第一線方案，但只有少數(shù)患者明顯受益，有效率僅有15%，其他的治療方式諸如基因治療、激素治療等，療效不肯定或無效，因此，尋找腎細(xì)胞癌新的預(yù)后指標(biāo)和治療方法非常重要[3，4]。

1963年Folkman等[5]發(fā)現(xiàn)有效抑制腫瘤血管的生長能阻止腫瘤的生長。1971年Folkman[6]又提出了腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴于血管的生長，認(rèn)為有效抑制腫瘤血管的新生可以治療腫瘤，腫瘤生長需要新生的血管，當(dāng)腫瘤體積超過1～2 mm3，如沒有血管的新生，腫瘤細(xì)胞就會死亡，新生血管的數(shù)量關(guān)系到腫瘤生長速度。曾有鼠移植瘤的研究結(jié)果表明[7]：當(dāng)無血管時，移植瘤生長緩慢，呈線性生長，而當(dāng)有血管生成時，移植瘤生長迅速，呈指數(shù)生長。

大部分腎透明細(xì)胞癌患者由VHL基因突變造成HIF-1α相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激活，使VEGF、PDGF等多數(shù)生長因子過度表達(dá)，使血管內(nèi)皮細(xì)胞過度分裂增殖，使新生血管增生，造成腎透明細(xì)胞癌是一種富有血管的實(shí)體腫瘤，而且腫瘤的微血管密度與腫瘤的預(yù)后相關(guān)。對于腎透明細(xì)胞癌的生物靶向治療就是抑制這些過度表達(dá)的血管生長因子[8，9]。使用單克隆抗體可以直接抑制過度表達(dá)的VEGF、PDGF、 EGF、TGF-α等血管生長因子，從而抑制腫瘤新生血管的形成，從而可以阻斷腫瘤的生長及轉(zhuǎn)移。目前這些治療腎透明細(xì)胞癌研究取得一定的進(jìn)展，在臨床上也有一定的治療效果。

1999年 Dawson[10]發(fā)現(xiàn)了PEDF能有效抑制血管的新生，是目前最強(qiáng)的內(nèi)源性血管生成抑制因子，其抑制血管新生的能力是血管抑素的2倍，是內(nèi)皮抑素的7倍。Abramson等[11]報道PEDF能有效抑制Wilms瘤的生長，正常腎小管上皮細(xì)胞中PEDF表達(dá)量明顯高于Wilms瘤中PEDF表達(dá)，由于PEDF的低表達(dá)降低了抑制腎Wilms瘤中血管新生的能力，從而導(dǎo)致Wilms瘤的血管密度增加，rPEDF可抑制Wilms瘤的生長。

我們曾報道[1]，腎透明細(xì)胞癌的PEDF表達(dá)與腫瘤MVD呈負(fù)相關(guān)，PEDF表達(dá)陽性者生存時間長于PEDF表達(dá)陰性者。為了研究rPEDF對動物移植腎透明細(xì)胞癌是否有相同的作用，我們建立小鼠的腎透明細(xì)胞癌動物模型，采用rPEDF瘤內(nèi)注射組及PBS瘤內(nèi)注射組。我們通過CD34來標(biāo)記腫瘤新生微血管，通過檢測小鼠移植腎透明細(xì)胞癌的微血管密度來確定rPEDF對腎透明細(xì)胞癌血管新生是否有影響，我們的結(jié)果表明rPEDF瘤內(nèi)注射組的腫瘤微血管密度明顯低于PBS注射組，另外我們還發(fā)現(xiàn)rPEDF治療組的腫瘤在接受2周的rPEDF移植瘤瘤內(nèi)注射后，移植瘤的直徑明顯小于只接受PBS注射的對照組，PEDF對腎透明細(xì)胞癌新生血管的抑制可有效抑制腎透明細(xì)胞癌增殖生長。雖然接受rPEDF瘤內(nèi)注射后腫瘤微血管密度下降程度大于腫瘤體積的下降程度，考慮腎透明細(xì)胞癌組織具有豐富的微血管，降低部分血管密度，腫瘤組織仍可靠周圍的細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)彌散擴(kuò)張，只有明顯降低微血管，才能減慢腫瘤生長。

國外研究表明[12]，rPEDF選擇性抑制新生血管的生長，不能抑制本身已經(jīng)存在的血管，另外研究[13]表明PEDF只對血管內(nèi)皮細(xì)胞有抑制作用，rPEDF不能抑制成纖維細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞，基于PEDF能特異性抑制腫瘤血管的新生，對于腎透明細(xì)胞癌的治療具有良好的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2013-03-04）