抗核抗體復(fù)篩查試驗(yàn)陰性與特異性抗體確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性的關(guān)聯(lián)

[摘要] 目的 探討抗核抗體（ANA）復(fù)篩查試驗(yàn)陰性與特異性抗體確認(rèn)試驗(yàn)陽(yáng)性的關(guān)聯(lián)。 方法 對(duì)2065例間接免疫熒光法（IIF）檢測(cè)陰性結(jié)果的樣本進(jìn)行免疫印跡法（LIA）檢測(cè)，并使用ELISA進(jìn)行輔助檢測(cè)。觀察IIF陰性結(jié)果下LIA、ELISA檢測(cè)結(jié)果，并對(duì)樣本稀釋度對(duì)結(jié)果的影響進(jìn)行深入研究。 結(jié)果 165例IIF陰性樣本經(jīng)LIA確認(rèn)為陽(yáng)性，其中以SS-A最多，達(dá)到29.76%。通過ELISA檢測(cè)SS-A，發(fā)現(xiàn)與LIA符合率達(dá)到88.0%；而通過降低樣本稀釋度，可以發(fā)現(xiàn)50%的樣本是因?yàn)樘禺愋钥贵w的濃度較低才漏檢的。 結(jié)論 對(duì)于高度懷疑為AID的患者，不管IIF檢測(cè)是否為陽(yáng)性，都應(yīng)該進(jìn)行LIA的復(fù)檢，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

[關(guān)鍵詞] 抗核抗體；特異性抗體；間接免疫熒光法；免疫印跡法

[中圖分類號(hào)] R446.6 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B [文章編號(hào)] 1673-9701（2013）20-0070-03

抗核抗體（ANA）檢測(cè)是目前臨床上診斷自身免疫性疾?。ˋID）最重要、可靠的一種實(shí)驗(yàn)室診斷手段，其中間接免疫熒光法（IIF）的使用最為廣泛[1，2]。隨著實(shí)驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，目前其他針對(duì)特異性抗體（ANAs）的新型檢查手段也不斷出現(xiàn)，如ELISA、免疫擴(kuò)散及免疫印跡等[3，4]。臨床工作中，IIF常常作為初步檢測(cè)存在，對(duì)檢測(cè)結(jié)果呈現(xiàn)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行特異性抗體確認(rèn)試驗(yàn)[5]。但臨床工作中發(fā)現(xiàn)，有時(shí)IIF與特異性抗體確認(rèn)試驗(yàn)結(jié)果差異較大。我科對(duì)2 065份IIF檢測(cè)陰性樣本進(jìn)行免疫印跡法（LIA）檢查，共發(fā)現(xiàn)15種特異性抗體。本研究試圖闡述IIF陰性樣本與LIA檢查的關(guān)系與意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究共納入受試者2 065例，均為我院2010年1月～2012年12月各科室申請(qǐng)ANA檢測(cè)的患者，ANA檢測(cè)均采用IIF，檢測(cè)結(jié)果均為陰性。其中男972例，女1 093例，年齡37～69歲，平均（52.1±13.3）歲?；颊呔鶠榍宄靠崭钩槿≈忪o脈血液5 mL，血液經(jīng)離心機(jī)離心5 min，轉(zhuǎn)速3 000 r/min，分離出血清。

1.2 IIF檢測(cè)

IIF檢測(cè)試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司，將分離出的血清稀釋，并使其與抗原基質(zhì)片反應(yīng)，時(shí)間為30 min（同時(shí)設(shè)陽(yáng)性和陰性對(duì)照），浸泡5 min，然后加入熒光標(biāo)記的二抗，避光孵育30 min，浸泡5 min。最后用甘油封片，在熒光顯微鏡下觀察并記錄結(jié)果，陽(yáng)性結(jié)果為抗體滴度≥1∶100。

1.3 LIA檢測(cè)

LIA檢測(cè)試劑購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司，特異性抗體檢測(cè)包括抗nRNP/Sm、Sm、SS-A、Ro-52、SS-B、Scl-70、PM-Scl、Jo-1、著絲點(diǎn)蛋白B（CENP B）、增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）、雙鏈DNA（dsDNA）、核小體（Nucleosome）、組蛋白（Histone）、核糖體（rRNP）以及線粒體-M2（AMA-M2）等15種。在第一次溫育時(shí)，將已經(jīng)1∶100稀釋的血清樣本2 mL與膜條上的靶抗原反應(yīng)，等待30 min后洗滌3次，共計(jì)15 min。之后加入抗人IgG（酶結(jié)合物，已經(jīng)酶標(biāo)記）1.5 mL反應(yīng)，等待30 min后洗滌3次，共計(jì)15 min。最終加入底物液反應(yīng)15 min，并用蒸餾水洗滌膜條，肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果。

1.4 ELISA定性檢測(cè)抗SS-A

試劑盒購(gòu)自德國(guó)歐蒙公司，以20 RU/mL的吸光度（A）值為定性分析臨界值。標(biāo)本1∶200稀釋，450 nm波長(zhǎng)比色。

1.5 正常對(duì)照組

選取20份經(jīng)IIF、LIA檢測(cè)均為陰性的血清樣本作為對(duì)照，稀釋度分別為1∶10、1∶32。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 14.0軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IIF檢測(cè)陰性與LIA檢測(cè)

2 065例血清樣本，IIF檢測(cè)后均為ANA陰性。所有樣本經(jīng)LIA檢測(cè)，2 065例樣本中，有165例為ANA陽(yáng)性。

2.2 LIA特異性抗體檢測(cè)分析

我們對(duì)165例IIF檢測(cè)陰性、LIA檢測(cè)陽(yáng)性的樣本進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)分析，發(fā)現(xiàn)包含15種不同的特異性抗體，見表1。

表1 LIA特異性抗體檢測(cè)分析

2.3 LIA檢測(cè)SS-A陽(yáng)性標(biāo)本與ELISA復(fù)檢分析

根據(jù)表1中的結(jié)果，可以發(fā)現(xiàn)SS-A的IIF檢測(cè)漏檢率最高，達(dá)到了29.76%。因此，將SS-A作為代表，進(jìn)行進(jìn)一步檢測(cè)。我們對(duì)經(jīng)LIA檢測(cè)SS-A陽(yáng)性血液樣本進(jìn)行ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)ELISA檢測(cè)后SS-A陽(yáng)性例數(shù)為44例，一致性達(dá)到88.0%。見表2。

表2 LIA檢測(cè)SS-A陽(yáng)性標(biāo)本與ELISA復(fù)檢分析

2.4 血液樣本稀釋度與IIF檢測(cè)SS-A陽(yáng)性分析

我們對(duì)初始樣本采用1∶100的稀釋比例，結(jié)果50例IIF檢測(cè)SS-A為陰性。因此，我們降低樣本的稀釋度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過降低稀釋度后，有50%原本SS-A陰性的樣本呈現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，與對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表3。

表3 血液樣本稀釋度與IIF檢測(cè)SS-A陽(yáng)性分析

注：*與對(duì)照組比較，P < 0.05

3 討論

抗核抗體（ANA）是一組將自身真核細(xì)胞的各種細(xì)胞核成分作為靶抗原的自身抗體的總稱，是目前自身免疫性疾病最常用的篩查指標(biāo)，主要存在于血清中，也可在胸水、關(guān)節(jié)滑膜液和尿液中出現(xiàn)?？购丝贵w在大多數(shù)自身免疫性疾病中均可呈陽(yáng)性，如SLE、RA、混合型結(jié)締組織病、干燥綜合征、硬皮病、多發(fā)性肌炎等，因此，ANA檢測(cè)目前普遍應(yīng)用于臨床診斷AID的工作當(dāng)中，也是當(dāng)前條件下確診疾病、提供治療的主要依據(jù)[6]。IIF曾作為臨床上自身抗體檢測(cè)的主要手段，由于其具有敏感性高、檢測(cè)方便以及能夠?qū)?xì)胞核、細(xì)胞漿、細(xì)胞骨架、細(xì)胞周期等自身抗體具有檢測(cè)范圍廣等優(yōu)點(diǎn)，一直作為自身抗體檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”[7-9]。隨著臨床診療與檢查技術(shù)的發(fā)展，發(fā)現(xiàn)IIF檢查缺乏特異性，因此對(duì)于一些AID疾病的診斷上存在一定的漏誤診可能[10]。隨著研究的深入，目前實(shí)驗(yàn)室研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)并確認(rèn)了許多細(xì)胞核靶抗原，相應(yīng)的特異性檢查手段也越來越多[11]。目前實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)常用的有ELISA、免疫擴(kuò)散以及免疫印跡等。LIA是近年來研究較多的一種檢測(cè)方法，研究表明[12]，LIA具有快速簡(jiǎn)單、自動(dòng)化操作等優(yōu)點(diǎn)，而且結(jié)果迅速易讀。此外，LIA一次可以檢測(cè)AID相關(guān)的多種特異性自身抗體，對(duì)AID的診斷和鑒別診斷、病情評(píng)估與治療監(jiān)測(cè)、病程轉(zhuǎn)歸與預(yù)后判斷等具有重要的臨床價(jià)值，且檢測(cè)的敏感度與準(zhǔn)確性相對(duì)較高，與ELISA同樣有著極高的診斷作用[13]。在日常檢驗(yàn)工作中，IIF常常作為AID疾病患者的初步診斷，但已有一些文獻(xiàn)顯示，IIF檢測(cè)的自身抗體與LIA檢測(cè)特異性抗體往往存在較大程度的差異[14，15]，因此本研究對(duì)IIF檢測(cè)陰性的血液樣本進(jìn)行LIA特異性抗體檢測(cè)。通過對(duì)兩者不同結(jié)果進(jìn)行分析，闡述該類標(biāo)本檢測(cè)自身特異性抗體的臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，2 065例IIF檢測(cè)ANA陰性樣本，經(jīng)過LIA檢測(cè)后165例為陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)過分析，我們發(fā)現(xiàn)，50例為SS-A的漏診，漏診比例明顯大于其他特異性抗體。因此，我們將SS-A作為代表進(jìn)行了進(jìn)一步研究。首先，我們采用ELISA對(duì)50例樣本進(jìn)行ANA檢查。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ELISA檢查下44例為陽(yáng)性結(jié)果，陽(yáng)性率為88.0%。說明LIA與ELISA在檢測(cè)特異性抗體方面，具有較高的符合率。因此，我們將樣本的稀釋度改變并進(jìn)行了IIF的重新檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在1∶10時(shí)，ANA陽(yáng)性為17例，1∶32時(shí)，ANA陽(yáng)性為8例，而1∶10時(shí)ANA陰性為25例。對(duì)照組中，1∶10時(shí)，ANA均為陰性。結(jié)果提示，50%的樣本是因?yàn)樘禺愋钥贵w的濃度較低才漏檢的。

綜上所述，IIF檢測(cè)自身抗體能夠出現(xiàn)15種類型特異性自身抗體的漏檢，而其中以SS-A漏檢率最為嚴(yán)重（29.76%）。因此，對(duì)于高度懷疑為AID的患者，不管IIF檢測(cè)是否為陽(yáng)性，都應(yīng)該進(jìn)行LIA的復(fù)檢，以提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性，為AID的臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)室診斷依據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 董曉微，胡朝軍，張道強(qiáng)，等. 抗核抗體與特異性自身抗體檢測(cè)結(jié)果不一致的臨床意義分析[J]. 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2011，26（9）：606-609.

[2] 柳明波，熊彪，黃素蘭，等. 免疫印跡法檢測(cè)161例自身免疫性疾病抗核抗體的結(jié)果分析[J]. 廣西醫(yī)學(xué)，2013，35（1）：69-71.

[3] 李俊，胡朝軍，沈波，等. 線性免疫印跡法在抗核抗體間接免疫熒光法篩查陰性標(biāo)本中的臨床意義[J]. 浙江醫(yī)學(xué)，2011，33（11）：1589-1592.

[4] 胡朝軍，李俊，張道強(qiáng)，等. 間接免疫熒光法篩查抗核抗體與特異性抗體檢測(cè)的相互關(guān)系[J]. 中華臨床免疫和變態(tài)反應(yīng)雜志，2011，5（3）：179-185.

[5] 張道強(qiáng)，隋秀梅，林榮海，等. 抗核抗體間接免疫熒光法檢測(cè)結(jié)果與抗核抗體譜免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果對(duì)比分析[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2010，31（11）：1212-1214，1217.

[6] 鄒自英，李素華，陳莉，等. 13種自身抗體檢測(cè)對(duì)SLE的診斷價(jià)值及臨床意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2007，23（5）：443-444，446.

[7] 周仁芳，胡朝軍，張蜀瀾，等. 抗核抗體篩查試驗(yàn)與特異性抗體確認(rèn)試驗(yàn)的相關(guān)性研究[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32（12）：1344-1348.

[8] 王細(xì)宏，朱書奇，胡義忠，等. 血清抗核糖體P蛋白抗體檢測(cè)對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡的診斷價(jià)值[J]. 安徽醫(yī)藥，2010，14（8）：916-917.

[9] 何蕊，徐蘭峰，宋秀軍，等. 抗核抗體譜檢測(cè)的臨床診斷意義[J]. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2011，27（9）：1017-1018.

[10] 張濤. 自身抗體聯(lián)合檢測(cè)在系統(tǒng)性紅斑狼瘡中的診斷價(jià)值[J]. 中國(guó)誤診學(xué)雜志，2011，11（7）：1572-1573.

[11] 程艷杰，王旭，朱鴻，等. 關(guān)于抗核抗體概念及核膜型臨床意義的建議[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（5）：477.

[12] 姚海紅，賈汝林，賈園，等. 2011年全國(guó)多中心自身抗體檢測(cè)質(zhì)量控制結(jié)果分析[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2012，16（12）：825-829.

[13] 張瑞，張括，王露楠，等. 2006-2011年中國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)自身抗體的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)[J]. 中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2012，35（3）：271-276.

[14] 茹晉麗，趙越，張莉蕓，等. 抗細(xì)胞膜DNA抗體檢測(cè)方法的建立及對(duì)系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷價(jià)值的臨床應(yīng)用研究[J]. 中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2012，16（1）：27-32.

[15] 吳風(fēng). ANA、抗ENA抗體法聯(lián)合檢測(cè)214例自身免疫性疾病的結(jié)果分析[J]. 中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012，16（2）：342-343.

（收稿日期：2013-05-13）