雷特格韋與利托那韋的體外代謝相互作用分析

【摘 要】目的：研究抗HIV藥物雷特格韋與利托那韋在大鼠原代肝細(xì)胞內(nèi)聯(lián)合用藥的藥代動力學(xué)，并分析其代謝相互作用。方法：大鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)后，分別以雷特格韋及利托那韋不同時間給藥。高效液相色譜法建立藥物檢測方法學(xué)，并以此分析細(xì)胞勻漿內(nèi)藥物濃度。結(jié)果：高效液相色譜測定方法學(xué)證明檢測效果良好，藥代動力學(xué)分析表明聯(lián)合用藥中兩種藥物在原代肝細(xì)胞內(nèi)代謝基本不受影響。結(jié)論：雷特格韋與利托那韋之間沒有藥物代謝相互作用，能夠在抗HIV臨床治療中聯(lián)合使用。

【關(guān)鍵詞】雷特格韋；利托那韋；藥代動力學(xué)；藥物相互作用

【中圖分類號】R91 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004-7484（2013）10-0621-02

臨床使用高效抗逆轉(zhuǎn)錄病毒療法（HAART）治療HIV-1感染中，HIV整合酶作用于病毒復(fù)制周期中前病毒DNA和宿主細(xì)胞染色體的整合過程，是最近抗HIV藥物研究的新靶點和新方向[1]。雷特格韋（Raltegravir，MK0518）作為第一個被FDA批準(zhǔn)上市的HIV整合酶抑制劑，能夠抑制整合過程中的鏈轉(zhuǎn)移反應(yīng)，從而減緩HIV病毒的復(fù)制進(jìn)程。在動物體內(nèi)和人體臨床安全性評價方面，雷特格韋具有較高的生物利用度和較好的耐受性，對中度肝功能和腎功能不全者不需要調(diào)整用藥劑量。同時也沒有發(fā)現(xiàn)較強(qiáng)烈的不良反應(yīng)。臨床實驗證明，雷特格韋能有效抑制多藥耐藥性患者體內(nèi)的復(fù)制數(shù)，并和其他抗病毒藥物具有良好的協(xié)同作用[2-4]。但對于雷特格韋與傳統(tǒng)HIV治療藥物如利托那韋（Ritonavir）、洛匹那韋等之間的代謝相互作用，目前仍無明確報道。本實驗擬通過原代細(xì)胞給藥培養(yǎng)以及高效液相色譜（HPLC）檢測方法，分析雷特格韋與利托那韋在原代肝細(xì)胞內(nèi)的代謝相互作用，從而為臨床治療聯(lián)合用藥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料：利托那韋及雷特格韋來自美國Merck公司；原代肝細(xì)胞由本實驗室自行分離自雄性SD大鼠；細(xì)胞培養(yǎng)液、小牛血清、Ⅳ型膠原酶和抗生素等均購自美國Gibco公司；蛋白檢測試劑盒購自凱基公司；本實驗中其他試劑和化合物，均來自美國Sigma-Aldrich公司。

1.2 大鼠原代肝細(xì)胞分離培養(yǎng)：對于大鼠原代肝細(xì)胞分離，我們采用下腔靜脈插管的逆向原位膠原酶循環(huán)灌注法，平均每次產(chǎn)量為3× 107個細(xì)胞，存活率約90%，培養(yǎng)效果良好。將細(xì)胞轉(zhuǎn)種到經(jīng)過膠原酶預(yù)鋪并清洗的細(xì)胞培養(yǎng)皿或培養(yǎng)板上，密度通常為5× 105個/ml，完全貼壁后給藥。培養(yǎng)基組成為Willams’E 培養(yǎng)液，其中含有1X青霉素和1.5μM胰島素，不含小牛血清。細(xì)胞培養(yǎng)于37oC恒溫培養(yǎng)箱中，CO2濃度為5%。

1.3 給藥分組：相同條件下培養(yǎng)的原代肝細(xì)胞隨機(jī)分為四組，分別為DMSO二甲亞砜（陰性對照組）、雷特格韋（Raltegravir）、利托那韋（Ritonavir）以及聯(lián)合用藥組，給藥濃度均為25μM。

1.4 HPLC樣品制備：原代肝細(xì)胞過夜培養(yǎng)后，經(jīng)藥物處理不同時間（0h ～ 24h）。在每個時間點收集細(xì)胞培養(yǎng)液1ml，細(xì)胞裂解后取懸液250μl，以1：1比例加入甲醇沉淀蛋白，在13000 rpm離心3 min，，再通過固相C-18柱提取藥物。過柱后的溶液經(jīng)過氮氣吹干，加入250μl甲醇/水（1：1）復(fù)溶。其余細(xì)胞懸液測定樣品蛋白濃度以作為HPLC實驗結(jié)果的校正。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析：所有實驗結(jié)果用mean ± SEM 表示。對于多組之間的比較，使用單因素方差分析（One Way ANOVA） 和 Student’s two-tailed t test 檢測組間顯著性差異。實驗結(jié)果使用Graphpad Prism 5軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析和圖表制作。組間差異小于0.05被認(rèn)為是具有顯著性的。

2 HPLC體外測定方法學(xué)建立

2.1 HPLC條件：使用Agilent 1200系列高效液相系統(tǒng)以及Beckman ODS C18反相柱；雷特格韋檢測流動相為乙腈/0.01%三乙胺（v/v = 40/60），熒光檢測激發(fā)波長299nm，發(fā)射波長396nm；利托那韋檢測流動相為乙腈/20mM NaH2PO4（v/v = 40/60），紫外檢測波長為210nm。

2.2 方法專屬性考察

取空白原代肝細(xì)胞懸液和加入雷特格韋或利托那韋的細(xì)胞懸液，獲得相應(yīng)色譜圖，考察細(xì)胞中內(nèi)源性物質(zhì)對藥物檢測峰的干擾。結(jié)果見圖1及圖2。由圖可見采用如上液相條件雷特格韋及利托那韋的的保留時間分別為6.592min及9.393min，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)不干擾雷特格韋的測定，分離度良好。

圖1 加入雷特格韋的細(xì)胞懸液HPLC色譜圖

圖2 加入利托那韋的細(xì)胞懸液HPLC色譜圖

2.3 線性考察

精密稱取雷特格韋或利托那韋適量，用1：1的甲醇/水混合溶液配制系列標(biāo)準(zhǔn)濃度梯度，濃度分別為0.1、1、2.5、5、10μg/ml，各取該系列標(biāo)準(zhǔn)溶液40μL進(jìn)樣，以雷特格韋濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，回歸得線性方程：y = 15.278x – 1.6395，R2 = 0.9998。以利托那韋濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，以峰面積（A）為縱坐標(biāo)，回歸得線性方程：y = 156.04x +2.7979，R2 = 0.9998。標(biāo)準(zhǔn)曲線證明檢測線性良好。

2.4 回收率及精密度考察

精確稱量雷特格韋及利托那韋適量，加入空白細(xì)胞懸液中配成低、中、高三個濃度的樣品各3批，由測得值與理論加入值相比較得藥物回收率。同樣取以上三種濃度的樣品測定日內(nèi)和日間精密度。雷特格韋低（0.55μg/ml）、中（3.18μg/ml）、高（8.07μg/ml）三個濃度的含藥細(xì)胞回收率分別為98.5±2.48%，98.4±2.11%，99.6±2.35%（n=3）。低、中、高三個濃度的日內(nèi)RSD分別為1.21%，1.93%，1.32%（n=3），日間RSD分別為2.12%，2.04%，2，98%（n=3）。利托那韋：低、中、高三個濃度的含藥細(xì)胞回收率分別為99.97±1.29%，99.88±1.26%，100.64±0.97%（n=3），日內(nèi)RSD分別為1.15%，1.53%，1.08%（n=3），日間RSD分別為1.10%，1.59%，1.49%（n=3）。結(jié)果證明本實驗方法回收率良好。

3 雷特格韋及利托那韋藥代動力學(xué)相互作用

我們首先對雷特格韋的藥代動力學(xué)進(jìn)行了研究。將雷特格韋單獨給藥或者與利托那韋聯(lián)合給藥，通過不同時間點測定原代肝細(xì)胞內(nèi)雷特格韋藥物的相對濃度，得到雷特格韋濃度變化的吸收曲線圖。結(jié)果如圖3所示。

圖3 雷特格韋吸收曲線（與利托那韋聯(lián)用）

使用Graphpad Prism軟件對攝取曲線圖進(jìn)行了統(tǒng)計學(xué)分析，計算雷特格韋具體的藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表1。曲線下面積（AUC）代表了整個給藥時間中，原代肝細(xì)胞對于雷特格韋的吸收量。可以發(fā)現(xiàn)，利托那韋作用下的雷特格韋藥物總吸收量和單用雷特格韋的對照組相比較，基本沒有變化。同時峰濃度時間Tmax和峰濃度Cmax指標(biāo)也都沒有明顯變化。結(jié)果表明，利托那韋不會影響肝細(xì)胞對于雷特格韋的吸收和代謝。

反過來，我們也對利托那韋的藥代動力學(xué)進(jìn)行了研究。實驗方法和上面一個實驗完全一致。同樣也使用軟件分析了相關(guān)的藥代動力學(xué)參數(shù)。結(jié)果如圖4和表2所示。

圖4利托那韋吸收曲線（與雷特格韋聯(lián)用）

實驗結(jié)果與前一個類似，雷特格韋對于利托那韋吸收曲線的AUC指標(biāo)都沒有顯著影響，也不會改變峰濃度以及峰濃度出現(xiàn)的時間。結(jié)果表明，雷特格韋同樣不會影響原代肝細(xì)胞對于利托那韋的吸收和代謝。

4 討論

醫(yī)學(xué)上定義的藥物相互作用指的是兩種或兩種以上藥物同時使用時，其中一種藥物作用的大小、持續(xù)時間甚至性質(zhì)受到另一種藥物的影響而發(fā)生明顯改變的現(xiàn)象。藥代動力學(xué)相互作用包括藥物在吸收、分布、代謝和排泄作用中任一環(huán)節(jié)受到的影響，從而引起了藥效學(xué)的改變。

體內(nèi)和體外肝微粒體中的實驗證明，HIV 蛋白酶抑制劑是通過細(xì)胞色素P450酶系代謝的，其中CYP3A4是主要的代謝酶。同時利托那韋被證明是CYP3A4和CYP2D6的強(qiáng)效抑制劑，能夠有效提高其他藥物的血藥濃度。因此盡管利托那韋具有較大的胃腸道副作用，在HAART臨床治療中仍然經(jīng)常被作為一個輔助藥物使用來增加治療效果[5]。

雷特格韋（Raltegravir）在體內(nèi)是通過UGT（尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶），主要是UGT1A1，經(jīng)葡萄糖醛酸化作用實現(xiàn)代謝的。而且雷特格韋不會激活或者抑制體內(nèi)藥物代謝相關(guān)酶的活性，III期臨床實驗證明，雷特格韋具有良好的安全性和較高的藥效[6，7]。

本實驗在大鼠原代肝細(xì)胞中針對雷特格韋及利托那韋分別建立了完整的高效液相色譜分析方法，具有良好的檢測效果。進(jìn)行的體外藥代動力學(xué)研究同樣表明，雷特格韋和利托那韋之間沒有藥物相互作用，不會影響各自的吸收和代謝。結(jié)果證明，在臨床治療中聯(lián)合使用雷特格韋及利托那韋，不會產(chǎn)生明顯的代謝反應(yīng)，具有良好的治療協(xié)同作用。

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通訊作者：

曹日昇 E-mail：felix1003@163.com