早期自然流產(chǎn)患者蛻膜和絨毛組織中VEGFmRNA的表達(dá)

【摘 要】目的：通過(guò)研究血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）在正常早期妊娠和早期自然流產(chǎn)蛻膜及其絨毛組織中的表達(dá)，初步探討VEGF與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系，為早期自然流產(chǎn)的發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)；方法：設(shè)30例早期自然流產(chǎn)患者為研究組，設(shè)30例正常妊娠分娩為對(duì)照組，采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測(cè)上述兩組蛻膜及絨毛組織中VEGFmRNA的表達(dá)；結(jié)果：1.在蛻膜組織中，早期自然流產(chǎn)組VEGFmRNA的表達(dá)量高于人工流產(chǎn)組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P﹥0.05）。2.在絨毛組織中，早期自然流產(chǎn)組VEGFmRNA的表達(dá)量高于人工流產(chǎn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；結(jié)論：VEGFmRNA在絨毛組織中的高表達(dá)可能與自然流產(chǎn)有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；早期自然流產(chǎn)；蛻膜；絨毛

【中圖分類(lèi)號(hào)】R714 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2013）10-0514-02

本實(shí)驗(yàn)采用半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)，檢測(cè)蛻膜及絨毛組織中VEGFmRNA表達(dá)量，并與正常妊娠分娩組進(jìn)行比較，探討母胎界面局部細(xì)胞因子在流產(chǎn)發(fā)病中的機(jī)理，為防治流產(chǎn)，提高人類(lèi)輔助生育技術(shù)的成功率提供依據(jù)。

1 材料

1.1 研究對(duì)象：病例組（自然流產(chǎn)組）：取自2012年7月—2012年9月北京市門(mén)頭溝區(qū)醫(yī)院婦產(chǎn)科，為既往月經(jīng)規(guī)律，停經(jīng)8-12周，B超證實(shí)無(wú)胎心搏動(dòng)，未經(jīng)藥物保胎治療的早孕患者，共30例。平均年齡28.31±1.52歲；平均孕周（7-11周）為8.16±1.58周。對(duì)照組（人工流產(chǎn)組）：B超證實(shí)胎兒有胎心搏動(dòng)且發(fā)育正常，既往無(wú)不良妊娠史，共30例。平均年齡27.49±1.68歲，平均孕周（7-11周）為8.25±1.28周。兩組平均年齡及平均孕周無(wú)差異。

1.2 標(biāo)本收集：自然流產(chǎn)組，孕囊自行排出者取其絨毛組織并在常規(guī)消毒下刮取蛻膜組織，孕囊未自行排出者行常規(guī)負(fù)壓吸引取絨毛及蛻膜組織；人工流產(chǎn)組，在常規(guī)負(fù)壓吸引下取其絨毛及蛻膜組織。

2 方法

RNA樣品經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)條件： 94℃變性30s；退火58℃1min；延伸72℃1min；共30個(gè)循環(huán)。然后將PCR產(chǎn)物上樣于1.5%瓊脂糖凝膠在100V電壓下電泳25min。電泳帶觀察：電泳完畢后，在透射紫外燈下觀察電泳帶，經(jīng)自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行凝膠成像，并用AlphaImager 2200 軟件對(duì)VEGF和GAPDH電泳條帶進(jìn)行灰度分析，VEGF和GAPDH逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物灰度比值即為VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)方法

數(shù)據(jù)以 ±S表示，兩組間VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量的比較采用兩樣本t檢驗(yàn)分析。

4 結(jié)果

本研究所用的VEGF引物序列為四種VEGFmRNA共有，RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物預(yù)期片段長(zhǎng)度分別為：VEGF121 452bp、VEGF165 548bp 、VEGF189 656bp 、VEGF206 707bp。在所有標(biāo)本中，都僅檢測(cè)到452bp的VEGF121和548bp的VEGF165，以及178bp的內(nèi)參基因GAPDH的表達(dá)（圖1）。自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)蛻膜和絨毛組織中VEGFmRNA相對(duì)表達(dá)量見(jiàn)表1和表2。

5 討論

妊娠是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，正常妊娠需要子宮內(nèi)膜具有完善的血管網(wǎng)絡(luò)使母胎之間能夠正常的進(jìn)行物質(zhì)交換[1]。VEGF是一類(lèi)具有高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂原， 與血管形成關(guān)系密切。目前已知其定位于6號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶上（6p12），基因全長(zhǎng)14kb， 有8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子[2、3]。

Shirashi等證實(shí)，整個(gè)生理妊娠過(guò)程中，人胎盤(pán)合體滋養(yǎng)細(xì)胞和絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞（間質(zhì)滋養(yǎng)細(xì)胞）均有VEGF的表達(dá)，隨著妊娠進(jìn)展，VEGF表達(dá)增加，到妊娠16周左右達(dá)到高峰，之后表達(dá)逐漸下降[4]。這與胎盤(pán)生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)間相吻合，說(shuō)明在胎盤(pán)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中VEGF具有重要的生理調(diào)節(jié)作用。Vuorela等[5]用免疫組化的方法分析有習(xí)慣性流產(chǎn)和稽留流產(chǎn)病人與正常早期終止妊娠的孕婦相比，胎盤(pán)滋養(yǎng)細(xì)胞和蛻膜VEGF表達(dá)降低。

有關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，在缺氧環(huán)境下，無(wú)論是體內(nèi)還是體外培養(yǎng)的絨毛組織，48小時(shí)后其VEGFmRNA表達(dá)量增加10倍，VEGF蛋白表達(dá)增加10.2倍[6]。Sharkey等[7]研究也發(fā)現(xiàn)，低氧可誘導(dǎo)子宮內(nèi)膜上皮和基質(zhì)VEGF分泌增高，而雌、孕激素并不能改變這種增高，證明低氧可作為一種獨(dú)立的因素調(diào)節(jié)VEGF分泌。

為探討VEGF與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系，本研究參考國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，采用可擴(kuò)增出VEGF121、VEGF165、VEGF189、VEGF206的引物，對(duì)早期自然流產(chǎn)蛻膜和絨毛內(nèi)VEGF的表達(dá)情況進(jìn)行研究。本實(shí)驗(yàn)用RT-PCR方法在自然流產(chǎn)和人工流產(chǎn)組的蛻膜和絨毛組織中均檢測(cè)到兩種VEGFmRNA異構(gòu)體，證實(shí)是VEGF121和VEGF165。本實(shí)驗(yàn)未檢測(cè)到VEGFmRNA的其它異構(gòu)體，產(chǎn)生這一現(xiàn)象的原因可能與基因的選擇性剪接具有組織特異性有關(guān)。

本研究顯示，1.在早期自然流產(chǎn)患者和人工流產(chǎn)患者蛻膜組織中，均可見(jiàn)VEGFmRNA的表達(dá)，且早期自然流產(chǎn)者高于人工流產(chǎn)者，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由此推測(cè)，蛻膜組織中VEGF與早期自然流產(chǎn)的關(guān)系并不反映在DNA或mRNA水平，而可能與蛋白質(zhì)的表達(dá)相關(guān)。2.在絨毛組織中，早期自然流產(chǎn)患者VEGFmRNA的相對(duì)表達(dá)量高于人工流產(chǎn)組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。分析可能是由于某種原因?qū)е戮植拷M織缺氧，從而刺激VEGF高表達(dá)。同時(shí)也有文獻(xiàn)指出，VEGF過(guò)度表達(dá)或不表達(dá)均能影響血管的生成 [8]。

自然流產(chǎn)病人妊娠時(shí)，部分病人或許由于局部組織缺血、缺氧，刺激VEGF的產(chǎn)生，促進(jìn)子宮絨毛組織血管生成，但表皮血管在數(shù)量、分支和大小上持續(xù)增加的同時(shí)伴隨血管的通透性增加，局部水腫，從而加重局部組織缺血缺氧的程度，導(dǎo)致胚胎發(fā)育停滯；另一方面又反饋性調(diào)節(jié)VEGF的過(guò)度分泌，表現(xiàn)為局部絨毛組織中的VEGF表達(dá)上調(diào)。因此，VEGF的高表達(dá)可能是子宮局部缺氧的結(jié)果，由此而導(dǎo)致的絨毛組織血管生長(zhǎng)障礙或生長(zhǎng)異常更加速胚胎發(fā)育停滯。

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