多發(fā)性骨髓瘤患者外周血T輔助細(xì)胞亞群的變化及其臨床意義

【摘 要】目的：檢測(cè)多發(fā)性骨髓瘤（MM）患者外周血Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量和比例的變化，并研究其與血β2微球蛋白（β2-MG）是否具有相關(guān)性，探討其T輔助細(xì)胞免疫功能狀態(tài)及臨床意義。方法：流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測(cè)31例MM患者及20例健康志愿者外周靜脈血Th1、Th2細(xì)胞的比例并分析比較。采用免疫比濁法測(cè)定患者血清β2-MG水平。結(jié)果：①.II、III期MM患者Th1細(xì)胞比例較對(duì)照組降低，為（8.24±1.25）%、（9.27±0.73）% VS（11.16±0.42）%（均P<0.05），MM組間及I期與對(duì)照組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；III期MM患者Th2細(xì)胞比例較對(duì)照組及I期降低，為（0.87±0.09）% VS（1.46±0.1）%、（1.7±0.26）%（均P<0.01），其余組間及與正常對(duì)照間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；III期MM患者Th1/Th2比值較對(duì)照組、I及II期增高，為（11.47±0.75）% VS（8.04±0.41）%、（6.04±1.19）%、（7.68±1.41）%（P<0.05或0.01）。②化療后復(fù)發(fā)組MM患者Th1細(xì)胞比例較對(duì)照組降低，為（7.99±1.19）% VS（11.16±0.42）%，（P<0.05），其余組間及與對(duì)照組間比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；初診組及化療后復(fù)發(fā)組MM患者Th2細(xì)胞比例較對(duì)照組及穩(wěn)定期組降低，為（1.02±0.12）%、（0.73±0.11）% VS（1.46±0.1）%、（1.5±0.22）%（均P<0.05）；初診組及化療后復(fù)發(fā)組MM患者Th1/Th2比值較對(duì)照組及化療后穩(wěn)定組增高，為（10.75±0.96）%、（11.43±1.25）% VS （8.05±0.41）%、（6.94±1.16）%（均P<0.05）。③MM患者Th2細(xì)胞與β2MG呈負(fù)相關(guān)（r=-0.376），Th1/Th2比值與其呈正相關(guān)（r=0.525）（p<0.05）。結(jié)論：MM患者外周血T輔助細(xì)胞亞群存在異常，Th1、Th2細(xì)胞比例降低及Th1/Th2比值增高與臨床分期、疾病進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)，對(duì)指導(dǎo)治療也有一定的價(jià)值。

【關(guān)鍵詞】多發(fā)性骨髓瘤；流式細(xì)胞術(shù)；TH亞群 ； β2微球蛋白

【中圖分類號(hào)】R739 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004—7484（2013）10—0082—02

Analysis of the expression of T helper cells in patients with multiple myeloma

Zeng Meixiu1， Xie Xiaobao2

Corresponding author Zeng Meixiu，Email：zengmx2007@163.com

（1.Department of emergency，zhejiang xiaoshao，hospital ，hangzhou ，311202，china）

（2.Department of Hematology，The Third Affiliated Hospital， Soochow University，Changzhou 213003，China）

【Abstract】Objective：To evaluate the changes of T helper cells and β2MG in peripheral blood of the patients with multiple myeloma for investigating their correlation， the immunological significance， and clinical significance. Methods：T helper cells in peripheral blood of 31 patients with MM and 20 healthy donors were measured by the flow cytometry， and β2-MG was tested by turbidimetric immunoassay. Results：①The proportion of Th1 was significantly lower in stages II and III MM than that in controls， （8.24±1.25）%、（9.27±0.73）% VS （11.16±0.42）%（P<0.05）； Th2 was significantly lower in stages III MM than that in controls and the stages I，（0.87±0.09）% VS（1.46±0.1）%、（1.7±0.26）%（P<0.01）；Th1/Th2 was significantly higher in stages III MM than that in controls and the stages I and II，（11.47±0.75）% VS（8.04±0.41）%、（6.04±1.19）%、（7.68±1.41）%（P<0.05 or 0.01），others were not different from controls.② The proportion of Th1 was obviously lower in MM of relapsing stage than that in controls， （7.99±1.19）% VS（11.16±0.42）%，（P<0.05）； Th2 was obviously lower in MM of relapsing stage and newly diagnosed than that in controls and stable stage，（1.02±0.12）%、（0.73±0.11）% VS（1.46±0.1）%、（1.5±0.22）%（P<0.05）； Th1/Th2 was obviously higher in MM of relapsing stage and newly diagnosed than that in controls and stable stage，（10.75±0.96）%、（11.43±1.25）% VS （8.05±0.41）%、（6.94±1.16）%（P<0.05）. ③ The proportion of Th2 negatively correlated withβ2MG（r=-0.376），Th1/Th2 positively correlated withβ2MG（r=0.525）（p<0.05）. Conclusion：MM patients had a had a low level of Th1 and Th2 but a high lever of Thl/Th2， which was associated with clinical stages ，disease progression and prognosis of MM， also valule to guide treatment.

【key words】Multiple myeloma； flow cytometry； T help cells；β2-MG

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤，其免疫功能障礙是該疾病的一個(gè)重要特征并與其發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)，而這些免疫缺陷相應(yīng)的臨床意義仍未完全明確[1]。輔助性T淋巴細(xì)胞（T helper，Th）在機(jī)體免疫應(yīng)答中處于中心地位，其不僅輔助激活CD8+T細(xì)胞， 而且對(duì)記憶性細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL）應(yīng)答的產(chǎn)生和維持起重要作用，還具有直接的抗腫瘤功能。一般地，輔助性T細(xì)胞中，Th1細(xì)胞分泌白細(xì)胞介素（interleukin， IL）-2， IL-12，IFN-γ，主要介導(dǎo)細(xì)胞免疫；Th2細(xì)胞分泌IL-4、IL-5、IL-10，主要參與體液免疫反應(yīng)。本研究采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)MM患者外周血Thl、Th2細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，并與血β2-MG預(yù)后指標(biāo)作相關(guān)性分析，初步探討其與MM發(fā)生發(fā)展、預(yù)后的關(guān)系及其臨床意義。一方面為有效干預(yù)患者的免疫功能提供參考，另一方面也為MM的免疫治療尋找一種新的手段。

1 材料和方法

1.1材料

鼠抗人單克隆抗體CD3-FITC、CD8-PercP、IFN-γ-PE、IL-4-PE及其相應(yīng)同型對(duì)照IgG1-PE、IgG2a-PE和FACS Calibur流式細(xì)胞儀均為美國(guó)Becton Dickinson（BD）公司產(chǎn)品。低溫冷凍離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)。佛波酯（phorbol 12-myristate-13-acetate，PMA）、離子霉素（Ionomycin）及BFA購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，RPMI1640培養(yǎng)液為本實(shí)驗(yàn)室配置。31例MM患者來自蘇州大學(xué)附三院、常州市第二人民醫(yī)院2010年12月到2012年12月門診或住院治療的患者，所有患者均符合國(guó)內(nèi)MM診斷標(biāo)準(zhǔn)[2]，其中男23例，女8例，平均年齡62（39-83歲）。免疫球蛋白分型IgG22例，IgA1例，IgD2例，輕鏈型6例。據(jù)Salmon和Durie分期I期5例，Ⅱ期4例，III期22例。初診MM患者14例，多程化療后穩(wěn)定期7例，復(fù)發(fā)期10例。正常對(duì)照20名，為健康志愿者，男14名，女6名，平均58（33-80）歲，均無腫瘤、外傷、感染、傳染病及自身免疫性疾病史。

1.2方法

1.2.1 Th1/Th2的檢測(cè)

無菌抽取患者和正常對(duì)照者外周血2ml，肝素鈉抗凝。取400ul，平均分為刺激管及未刺激管，前者加入PMA （1ug/m L） 、ionomycin （50ug/ mL） 以擴(kuò)大原有細(xì)胞因子的產(chǎn)量，及BFA（0.5mg/ml）抑制高爾基體對(duì)細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)運(yùn)。后者僅加入BFA?；靹蚝蠓挚准尤?6孔板中，37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h。收集細(xì)胞各分對(duì)照管和試驗(yàn)管，分別加入20ulCD3、CD8進(jìn)行胞膜表面標(biāo)記染色，避光孵育15min，固定洗滌細(xì)胞進(jìn)行破膜及胞內(nèi)因子標(biāo)記，每管中加入100ul破膜劑及相應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)因子單抗IFN-γ、IL-4和相應(yīng)陰性對(duì)照各20ul， 室溫避光15 min。洗滌并500ul PBS重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)。采用Cellquest或WinM-DI2.9軟件獲取分析細(xì)胞，先以側(cè)向散射角（SSC）及CD3確定CD3+T淋巴細(xì)胞群，再以CD3和CD8單抗設(shè)門，用CD3 + CD8- 細(xì)胞群中IFN-γ和IL-4 的陽(yáng)性表達(dá)率來分析Th1、Th2 細(xì)胞的表達(dá)水平，記錄陽(yáng)性細(xì)胞百分率，每次均收集細(xì)胞10 000個(gè)。

1.2.2 β2微球蛋白的檢測(cè) 清晨空腹抽取患者和正常對(duì)照者靜脈血5 ml ，肝素鈉抗凝，3 000 r/min離心10 min，分離血清后進(jìn)行檢測(cè)，方法為透射免疫比濁法。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)以 ±s表示，獨(dú)立t檢驗(yàn)、一元方差分析均由SPSS11.5 for Windows統(tǒng)計(jì)軟件完成。部分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行Spearman相關(guān)分析。P﹤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1不同臨床分期MM患者TH細(xì)胞亞群的變化 II、III期MM患者Th1細(xì)胞較對(duì)照組降低（P < 0.05）；III期MM患者Th2細(xì)胞比例較對(duì)照組及I期降低（P < 0.05）；III期MM患者Th1/Th2比值較對(duì)照組、I及II期增高（P < 0.05），見表1。

2.2 不同病情分期MM患者TH細(xì)胞亞群的變化 化療后復(fù)發(fā)組MM患者Th1細(xì)胞比例較對(duì)照組降低（P < 0.05或< 0.01）；初診組及化療后復(fù)發(fā)組MM患者Th2細(xì)胞比例較對(duì)照組及穩(wěn)定期組降低（P < 0.05）；初診組及化療后復(fù)發(fā)組MM患者Th1/Th2比值較對(duì)照組及化療后穩(wěn)定組增高（P < 0.05），見表2。

2.3 Th細(xì)胞亞群與β2MG相關(guān)分析 通過相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)Th2細(xì)胞與β2MG呈負(fù)相關(guān)，TH1/TH2與其呈正相關(guān)，結(jié)果見表3。

3 討論

MM是一種免疫系統(tǒng)的惡性腫瘤，近年來，其免疫系統(tǒng)的多種缺陷已被國(guó)外研究者報(bào)道，國(guó)內(nèi)也有研究[3]顯示，MM患者CD4+細(xì)胞、CD8+細(xì)胞隨臨床分期和病情進(jìn)展而變化，說明其機(jī)體免疫功能與疾病狀態(tài)密切相關(guān)，但進(jìn)一步的研究尚缺乏。T淋巴細(xì)胞是最重要的免疫細(xì)胞，CD4+細(xì)胞主要為輔助性T淋巴細(xì)胞，其在免疫應(yīng)答中處于中心地位，可調(diào)控其他淋巴細(xì)胞的功能，Th1細(xì)胞通過產(chǎn)生IL-2、IFN-γ激活CD8+CTL并使其增殖，發(fā)揮抗腫瘤、細(xì)菌及病毒的作用，同時(shí)IL-2、IFN-γ也能增加NK細(xì)胞的抗腫瘤活性。而Th2細(xì)胞通過分泌IL-4和IL-10等，主要協(xié)助B細(xì)胞產(chǎn)生IgG 、IgA和IgE等抗體，調(diào)節(jié)體液免疫。機(jī)體的免疫格局通過Th1和Th2細(xì)胞的比例而調(diào)節(jié)。

IFN-γ和IL-4是Thl和Th2細(xì)胞的標(biāo)志性細(xì)胞因子，通過檢測(cè)這兩種細(xì)胞因子可以反映兩種細(xì)胞的狀態(tài)與功能。我們利用流式細(xì)胞術(shù)結(jié)合細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色技術(shù)測(cè)定MM患者外周血CD4+ T淋巴細(xì)胞誘生IFN-γ和IL-4的情況，在T細(xì)胞水平基礎(chǔ)上進(jìn)一步揭示其T細(xì)胞功能狀態(tài)及臨床意義。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，II、III期MM患者Th1細(xì)胞比例較對(duì)照組降低，III期MM患者Th2細(xì)胞比例較對(duì)照組及I期降低，且均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明隨著腫瘤負(fù)荷增加，MM患者不僅存在細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能缺陷，體液免疫功能也受很大程度的影響。與大多數(shù)研究報(bào)道的其他實(shí)體腫瘤患者呈Th2型優(yōu)勢(shì)狀態(tài)從而保護(hù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸不同，MM患者Th2細(xì)胞較Th1細(xì)胞比例呈更明顯的降低，與Yi 等[4]報(bào)道的進(jìn)展期MM患者呈Th2優(yōu)勢(shì)狀態(tài)不同，可能與實(shí)驗(yàn)方法差異及病例選擇有關(guān)。MM患者Th2細(xì)胞比例下調(diào)，免疫功能受損，可能也是其容易并發(fā)感染的重要原因之一。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，III期MM患者Th1/Th2比值較對(duì)照組、I及II期均明顯增高，且該比值增高是由于Th2細(xì)胞比例下降更為明顯所致，與Ogawara 等[5]研究報(bào)道相符。

通過研究MM患者T輔助細(xì)胞亞群與病情關(guān)系發(fā)現(xiàn)，Th1、Th2細(xì)胞比例降低及Th1/Th2比值增高主要發(fā)生在MM初診期及治療后復(fù)發(fā)期，而穩(wěn)定期則無明顯異常。提示MM患者外周血T輔助細(xì)胞亞群變化與病情有關(guān)。而且，有效的化療使病情達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)時(shí)，免疫功能也隨之恢復(fù)。另外，與β2-MG預(yù)后因子相關(guān)性研究發(fā)現(xiàn)，MM患者Th2細(xì)胞與β2-MG呈負(fù)相關(guān)，Th1/Th2比值與其呈正相關(guān)，提示其與MM預(yù)后存在一定相關(guān)性。

另外，CD4+T細(xì)胞中還有一群具有免疫負(fù)調(diào)控功能的CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群，其在維持對(duì)自身成分免疫耐受的同時(shí)，也可能阻止了機(jī)體對(duì)自體同源腫瘤細(xì)胞的免疫，導(dǎo)致腫瘤的免疫抑制及免疫逃逸。韓文敏等[6]通過流式檢測(cè)MM患者外周血CD4+CD25+/highCD127low調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例明顯增高，且與治療及疾病進(jìn)展程度相關(guān)，但對(duì)增高的原因尚未明確。而Wei等[7]在小鼠體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，初始T細(xì)胞在分化為FOXP3+Tregs過程中，受Th1/Th2極化細(xì)胞因子IL-12， IFN-γ和IL-4的負(fù)性調(diào)節(jié)，且以IL-4的作用最為顯著。因此，結(jié)合我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)MM患者調(diào)節(jié)T細(xì)胞增高可能與Th1、Th2細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子減少有關(guān)。此值得進(jìn)一步研究。

總之，本研究結(jié)果表明，MM患者存在T輔助細(xì)胞亞群表達(dá)異常，并與臨床分期、病情進(jìn)展及預(yù)后相關(guān)。初步顯示了MM 患者T輔助細(xì)胞免疫功能缺陷，而在腫瘤發(fā)展的不同時(shí)期檢測(cè)T細(xì)胞亞群及Th細(xì)胞因子的狀態(tài)和變化，對(duì)了解患者的免疫狀態(tài)，指導(dǎo)治療具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] Pratt G， Goodyear O， Moss P. Immunodeficiency and immunotherapy in multiple myeloma[J].Br J Haematol，2007，138（5）：563-579

[2] 張之南，沈悌. 血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M].2版.北京：科學(xué)出版社，1998：373-380

[3] 賈 麗，邱國(guó)強(qiáng)，謝曉寶. 多發(fā)性骨髓瘤患者T細(xì)胞亞群CD28表達(dá)及其臨床意義[J]. 臨床薈萃，2008，23（23）：1692-1694

[4] Yi Q， Osterborg A， Bergenbrant S， et al. Idiotype-reactive T-cell subsets and tumor load in monoclonal gammopathies. Blood ，1995，86：3043–9.

[5] Ogawara H， Handa H， Yamazaki T et al. High Th1/Th2 ratio in patients with multiple myeloma [J]. Leuk Res， 2005 ，29（2）：135-40

[6] 韓文敏 ，邱國(guó)強(qiáng)，謝曉寶等，CD4+CD25+/high CD127low Tregs及TGF-β在多發(fā)性骨髓瘤患者外周血的表達(dá)分析. 細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志[J]. 2008，24 ：996-998

[7] Wei J， Duramad O， Perng OA et al. Antagonistic nature of T helper 1/2 developmental programs in opposing peripheral induction of Foxp3+ regulatory T cells. Proc Natl Acad Sci U S A[J]. 2007，104（46）：18169-74