免疫比濁法和免疫熒光定量法測定D—二聚體的研究比較

【摘 要】探討免疫比濁法和免疫熒光定量法測定D-二聚體的可行性以及在臨床的應(yīng)用價值。 在STAGO血凝分析儀上采用免疫比濁法測定D-二聚體，在美國博適Triage檢測儀上采用免疫熒光定量法測定D-二聚體，對兩種不同方法測定D-二聚體進行比較。試驗數(shù)據(jù)表明：免疫比濁法測定D-二聚體的重復(fù)性好于免疫熒光定量法；兩種方法測定D-二聚體在線性范圍、靈敏度、抗干擾能力接近，試劑穩(wěn)定性均能保存一年；美國博適Triage檢測儀的免疫熒光定量法使用方便，是一種準(zhǔn)確、簡捷的測定方法，適用于臨床的急診心肺功能五聯(lián)檢驗；STAGO血凝分析儀的免疫比濁法定量檢測D-二聚體含量方便、快捷，敏感性高，易在大多數(shù)醫(yī)院普遍推廣

【關(guān)鍵詞】二聚體；血栓形成；免疫熒光定量法

【中圖分類號】R446 【文獻標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）10—0074—02

D-二聚體（D-Dimer，D-D） 是纖維蛋白單體經(jīng)活化因子XIII交聯(lián)后，再經(jīng)纖溶酶水解所產(chǎn)生的一種特異性降解產(chǎn)物，是一個特異性的纖溶過程標(biāo)記物。只要機體血管內(nèi)有活化的血栓形成及纖維溶解活動，D-二聚體就會升高。其對靜脈血栓形成高度敏感，在排除靜脈血栓形成的診斷中具有極其重要的價值。另外，D-D在心血管疾病、DIC、惡性腫瘤等疾病也有明顯變化，足反映疾病嚴重程度、發(fā)展變化、以及療效和預(yù)后的有用指標(biāo)[1-2]在全血或血漿中，利用D-D的抗體可以很容易的檢測到D-D含量。已建立了多種有價值的D-D的檢測方法[3]。但臨床上迫切需要一種取樣簡單、操作方便、時間節(jié)約、結(jié)果準(zhǔn)確的D-D測定方法。其中臨床實驗室常規(guī)檢測方法是免疫比濁法。筆者采用麗水中心醫(yī)院檢驗科2種測定D-D的方法并加以對照分析，為臨床采用正確的D-D檢測方法提供依據(jù)，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本：樣本來源于麗水中心醫(yī)院門診患者和病房患者2012年6月至12月收集的80例血清標(biāo)本（其中無溶血、黃疸、乳糜的正常人血漿60例，無溶血、黃疸、乳糜的D-二聚體高值血20例，濃度在8～16μg/mL之間）。儀器采用法國STAGO血凝分析儀；美國博適Triage檢測儀。

1.2 試劑：STAGO公司提供的免疫比濁法所用試劑、定標(biāo)液和質(zhì)控液；免疫熒光定量法所用試劑為杭州麗珠醫(yī)療器械有限公司生產(chǎn)。

1.3 方法：D-D測定在法國STAGO血凝分析儀上采用免疫比濁法，在美國博適Triage檢測儀上采用免疫熒光定量法 。兩種方法均按照試劑盒說明書、儀器說明書來設(shè)置相關(guān)參數(shù)進行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理：應(yīng)用SPSS20.0統(tǒng)計學(xué)軟件，對所測有關(guān)精密度的數(shù)據(jù)進行正態(tài)分布檢驗，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，進行成組t檢驗，對回收率進行卡方檢驗 。

2 結(jié)果

2.1 線性與靈敏度：取D-D配制濃度為6.0μg/mLD-二聚體標(biāo)準(zhǔn)液，用生理鹽水稀釋成5種不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)液（0.25，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0）。分別用免疫比濁法和免疫熒光定量法測定D-D，進行線性試驗。結(jié)果表明，免疫比濁法測定D-D，回歸方程為y=0.024x+0.054，r=0.9992，線性關(guān)系良好。線性范圍為0.22～4μg/ml。免疫熒光定量法測定D-D，線性范圍為0.1～5μg/mL，回歸方程為y=0.024 x+0.046，r=0.9996。在低于4μg/ml范圍內(nèi)兩種方法測定D-D的線性范圍接近。免疫比濁法的靈敏度為0.22μg/ml，免疫熒光定量法的靈敏度為0.1μg/mL。如需檢測更高濃度的血漿D-D水平，則需對血漿標(biāo)本進行預(yù)稀釋。

2.2 精密度：將患者血漿配制為中、低2種不同濃度，各測20次。在STAGO血凝分析儀上采用免疫比濁法測定D-D.（D-D濃度在0.55±0.05μg/mL的CV為8.8%，D-D濃度在1.75μg/mL的CV值為5.0%）在美國博適Triage檢測儀上采用免疫熒光定量法測定D-D（D-D濃度在0.68±0.07μg/mL的CV為10.8%，D-D濃度在1.80±0.11μg/mL的CV值為6.0%）。免疫比濁法的精密度優(yōu)于免疫熒光定量法，兩種檢測方法在低、中濃度比較中有顯著性統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果見表1.

2.3 干擾試驗：在體外向正常人血漿中加入不同濃度膽紅素、脂肪乳、血紅蛋白。根據(jù)加入干擾物質(zhì)前后的測定值判斷干擾因素的影響結(jié)果。當(dāng)加入的最高濃度為血紅蛋白<5g/l，膽紅素<200mg/l，甘油三脂<22.6mmol/l時兩者的檢測結(jié)果無影響。

2.4 回收率試驗：取無黃疸、溶血、乳糜的正常人混合血漿，用免疫比濁法和免疫熒光定量法分別測定D-D，作為基值。加入D-D標(biāo)準(zhǔn)液0.555μg/mL，作回收率試驗。免疫比濁法法測定D-D的回收率為101.4%，免疫熒光定量法回收率為102.81%。免疫比濁法法和免疫熒光定量法無統(tǒng)計學(xué)意義（ⅹ2值為3.34.P>0.05）。

2.5 試劑穩(wěn)定性試驗 將試劑放置4℃冰箱1y，每月抽檢，檢測D-D正常水平與高值水平。并將試劑置室溫22℃，7d，同樣檢測D-D正常水平與高值水平。結(jié)果顯示免疫比濁法法和免疫熒光定量法所用試劑在4℃環(huán)境能放置1y，在室溫條件下可放置7d。其檢測性能未見改變。

3 討論

D-二聚體是交聯(lián)纖維蛋白降解的特異性分子標(biāo)志物， D-二聚體的檢測具有非常的臨床意義。

在繼發(fā)性纖維蛋白溶解功能亢進是常呈現(xiàn)陽性或增高，如彌漫性血管內(nèi)凝血、腎臟疾病、高凝狀態(tài)、器官移植排斥反應(yīng)、溶栓治療等。D-二聚體在孕產(chǎn)婦的檢測中也尤其重要，李帥，呂時銘，湯杰英在“浙江地區(qū)漢族孕產(chǎn)婦D.二聚體參考區(qū)間的建立及應(yīng)用”中闡述個孕婦各期的參考區(qū)間，對預(yù)防孕婦DIC具有非常重要的價值[4]。D-二聚體在消化道惡性腫瘤、肺癌、急性白血病等惡性腫瘤患者中的臨床意義相繼也有學(xué)者做過研究。所以檢測血漿D-二聚體已成為判斷血栓形成危險性直接而實用的方法。D-二聚體檢測方法有免疫比濁法、免疫熒光定量法、膠乳凝集法、ELISA雙抗夾心法、膠體金免疫滲透試驗等。然而D-二聚體檢測方法不同，在臨床應(yīng)用中存在差異[5] ， 十分有必要進行方法比較和評價。本試驗對科內(nèi)檢測D-D的2種方法研究比較：熒光免疫免疫熒光定量法相對于免疫比濁法法更為簡便、快捷。且精密度、線性均較好。為筆者科內(nèi)心肺功能五聯(lián)檢（肌紅蛋白、BNP、CTnI、CK-MB、D-D）的一個項目，對由于急性心肌梗死、心衰等心血管疾病引起的急性心肌塞、急性DIC、肺栓死提供更快、更有價值的信息[6]。但由于價格較貴，對于非心血管疾病引起的急性DIC、肺栓死，腦梗死、急性心肌梗塞、肝硬化、腫瘤、急性非淋巴細胞白血病、敗血癥等疾病引起的血漿D-二聚體水平的變化STAGO血凝分析儀的免疫比濁法法是個較佳的選擇。免疫比濁法通過不斷研究和實驗程序優(yōu)化，通過對預(yù)稀釋樣本提高了檢測線性范圍至0～16μg/ml.[7]。且對免疫比濁法檢測D-D的性能評價已較成熟[8-10]，而免疫熒光定量法檢測D-D的性能評價研究較少，兩種方法的比對分析也較少。所以免疫比濁法適合于大批量的篩查試驗，而免疫熒光定量法測D-DD的檢測方法有待進一步優(yōu)化試驗方法。

參考文獻：

[1] 張海燕，白巖松，李春盛.D-二聚體在急診急性心血管疾病患者中的應(yīng)用價值[J].中國醫(yī)學(xué)院科學(xué)院學(xué)報，2011，33（1）：92-95.

[2] 張瑜，楊寧榕，王峰.晚期惡性腫瘤患者凝血功能及D-二聚體水平檢測的臨床意義[J].實用癌癥雜志，2012，27（2）：165-167.

[3] 董懷平，綜述，李慶敏.D一二聚體的研究進展[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2006，27（12）：1134-1135.

[4] 李帥，呂時銘，湯杰英.浙江地區(qū)漢族孕產(chǎn)婦D-二聚體參考區(qū)間的建立及應(yīng)用[J].中華檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2011，34（7）：580-586.

[5] 佟廣輝，佟威威，溫 峰. 不同定量檢測D-二聚體方法的比較分析[J].山西醫(yī)藥雜志2012，41（6）：609-610.

[6] 陳小君，孟淑娟，楊凱. cTnT、CK-MB、FIB和DD聯(lián)合檢測在急性心肌梗死中的診斷價值[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（12）：1440-1441.

[7] 鄭衛(wèi)東，曾淑燕，免疫比濁法定量檢測D-二聚體的實驗程序優(yōu)化及試劑價值[J].現(xiàn)在檢驗醫(yī)學(xué)雜志2005，20（6）：42-44.

[8] 馮厚德，孫德華，鄭磊. Sysmex CA 7000全自動凝血儀進行性能評價[J].檢驗醫(yī)學(xué)，2011，26（01）：58-62.

[9] 丁鈺，鄭春喜，李靜.不同血凝分析儀的凝血項目校正及比對試驗[J].醫(yī)學(xué)檢驗與臨床，2009，20（5）：8-10.

[10] 許小英，于海濤，周存敏.某型號全自動血凝分析儀的性能評價[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2012，33（11）：1361-1362，1369.