皮下軟組織細(xì)菌感染動物模型的建立與評價

【摘 要】目的：建立一種局部軟組織細(xì)菌感染的動物模型。方法：皮下注射含2.4×106～2.4×10-1CFU·mL-1A族乙型溶血性鏈球菌的瓊脂染菌載體，觀察小鼠在7d內(nèi)的生存狀態(tài)和局部感染皮球的顏色、形態(tài)等癥狀，確定最佳染菌濃度，制作小鼠皮下細(xì)菌性感染模型，并用魚石脂軟膏作為治療藥物檢驗?zāi)Ｐ偷姆€(wěn)定性。

【關(guān)鍵詞】溶血性鏈球菌；軟組織感染；動物模型

【中圖分類號】R332 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】1004—7484（2013）10—0053—01

皮膚及軟組織常見的化膿性感染主要有毛囊炎、癤、癰、急性蜂窩組織炎、膿腫、丹毒、急性淋巴管炎等.而溶血性鏈球菌是常見的病原菌，極易引起急性彌漫性化膿性感染，炎癥可由局部化膿性感染灶直接擴(kuò)散或經(jīng)淋巴、血流傳播而發(fā)生全身性感染，主要癥狀有高熱、寒戰(zhàn)、頭痛、白細(xì)胞計數(shù)增加等。建立一種符合臨床特點的皮膚軟組織細(xì)菌感染動物模型，尤其是建立易操作、成本低、實驗結(jié)果再現(xiàn)性好的小動物感染模型，對研究和開發(fā)能有效治療局部細(xì)菌性感染的藥物具有十分重要的價值。

1材料與方法

1.1動物

昆明種小鼠，SPF級，雄性，20 g±2g，在20℃±2℃控溫和光暗周期各12h環(huán)境飼養(yǎng)，自由飲水。合格證號：SCXK（甘）2010-0004號，由蘭州大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2藥品與試劑

魚石脂軟膏，10%，國藥準(zhǔn)字H34020316，蕪湖三益制藥有限公司，批號：091204；白凡士林，上海大場化工廠，批號：061105；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)，批號：20100816；A族乙型溶血性鏈球菌，甘肅中醫(yī)學(xué)院病原微生物教研室提供。

1.3主要儀器

DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海益恒實驗儀器有限公司）；SW-CJ-2G型雙人化工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；BS110型電子天平（德國Sartorius）。

1.4主要指標(biāo)和檢測方法

1.4.1建立小鼠皮下軟組織細(xì)菌感染模型

參考文獻(xiàn)[1]并依據(jù)預(yù)實驗結(jié)果，小鼠皮下注射A族乙型溶血性鏈球菌菌液，細(xì)菌計數(shù)在2.4×106CFU·mL-1以上時3d內(nèi)全部死亡，因此可引起小鼠100%死亡的最小菌液濃度為2.4×106CFU·mL-1，可作為建立感染動物模型的基礎(chǔ)菌液濃度[2]。

取小鼠36只，實驗前24h，用8%Na2S涂于背部脫毛，面積約2cm×2cm，按體重隨機(jī)分為6組，取基礎(chǔ)菌液濃度[3]用5%高活性干酵母以10倍稀釋成不同濃度（2.0×107～2.0×101CFU·mL-1）的受試菌液，分別取3mL菌液加入7mL瓊脂（3%，NS，60℃保溫）制備染菌載體，分別取染菌載體0.4mL于小鼠背部脫毛區(qū)皮下注射，隆起皮丘者納入實驗。細(xì)菌培養(yǎng)與計數(shù)在超凈工作臺上進(jìn)行，染菌動物模型建立及藥效學(xué)實驗在SPF級實驗室內(nèi)進(jìn)行。觀察各小鼠染菌后24h、48h和72h的皮丘顏色和形態(tài)，進(jìn)行定量評分，評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)臨床癥狀和預(yù)實驗結(jié)果擬定[3]。

1.4.2魚石脂軟膏對小鼠皮下軟組織細(xì)菌感染的保護(hù)作用

取小鼠36只，給藥前24h將背部脊柱兩側(cè)脫毛，面積約2cm×2cm，8%Na2S涂于背兩側(cè)5min后，用紗布擦洗凈。隨機(jī)分成3組，每組12只，設(shè)空白對照組、魚石脂軟膏大劑量組和小劑量組；各組小鼠分別在脫毛區(qū)涂抹白凡士林0.4g·只-1、魚石脂軟膏0.4g·只-1、魚石脂軟膏0.2g·只-1，每天1次，連續(xù)3天，末次給藥6h后，空白對照組各小鼠皮下注射3%瓊脂0.4mL（NS溶脹，60℃保溫），其余各組小鼠皮下注射2.4×104CFU·mL-1A族乙型溶血性鏈球菌染菌載體0.4mL（3%瓊脂，60℃保溫），注意無菌操作。繼續(xù)涂藥，連續(xù)6d，每次涂藥前按1.4.1項評分標(biāo)準(zhǔn)給每只小鼠評分，記錄各小鼠總分值。

1.5統(tǒng)計學(xué)方法

實驗結(jié)果以 ±s表示，采用方差分析比較，組間差異采用q檢驗，以P<0.05作為差異具有顯著性的標(biāo)準(zhǔn)，采用SPSS13·0軟件進(jìn)行分析。

2結(jié)果

2.1小鼠皮下軟組織細(xì)菌感染模型的建立

結(jié)果顯示，7d內(nèi)引起小鼠100%死亡的最小菌液濃度為2.4×104 CFU·mL-1，以此濃度進(jìn)行皮下軟組織內(nèi)注射建立細(xì)菌性局部感染動物模型，動物存活情況良好，局部感染癥狀與臨床特征比較一致，見表1。

2.2魚石脂軟膏對小鼠皮下軟組織細(xì)菌感染的保護(hù)作用

結(jié)果顯示，魚石脂軟膏大、小劑量對小鼠皮下注射A族乙型溶血性鏈球菌引起的感染有明顯抑制作用，小鼠存活數(shù)明顯提高，感染癥狀明顯改善，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01或P <0.05），見表2。

3 討論

局部感染是指病原菌侵入機(jī)體后，在一定部位定居下來，生長繁殖，產(chǎn)生毒性產(chǎn)物，不斷侵害機(jī)體的感染過程。皮膚感染的動物模型由于動物表皮接觸空氣易風(fēng)干及動物吮舔等原因不易建立，并且很難達(dá)到感染程度一致的結(jié)果。

本研究采用A族乙型溶血性鏈球菌皮下注射引起局部感染，為了便于觀察感染癥狀，采用皮下瓊脂塊作為指示性感染部位，制作方法簡便易行，觀察指標(biāo)簡單準(zhǔn)確。同時采用魚石脂軟膏治療感染小鼠，感染小鼠在用藥組和不用藥組體征有明顯的差別，可以用于抗感染藥物的篩選。

參考文獻(xiàn)：

[1] 黃金華，徐濟(jì)良，張偉.銀黃健膚露抗炎抑菌作用研究[J].南通大學(xué)學(xué)報，2005，25（6）：430-433

[2] 陳奇.中藥藥理研究方法學(xué)[M].第二版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006.310-311

[3] 李婭娣，楊秀敏，王毓新.茄病鐮刀菌致ICR小鼠局部皮膚感染的實驗研究[J].中國實驗動物學(xué)報，2006，14（2）： 105-108