TGF—β2在骨髓纖維化患者骨髓組織中的檢測(cè)分析

【摘 要】目的：通過(guò)本研究闡釋TGF-β2（transforming growth factor， beta 2）與骨髓纖維化的關(guān)系。方法：采用骨髓塑料包埋法制備半薄切片，利用免疫組化技術(shù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組骨髓組織中TGF-β2的表達(dá)情況。結(jié)果：骨髓纖維化患者骨髓組織中TGF-β2的表達(dá)低于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。結(jié)論：TGF-β2在骨髓纖維化的發(fā)生中具有重要作用。

【關(guān)鍵詞】骨髓；纖維化；TGF-β2

【中圖分類號(hào)】R68 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004—7484（2013）10—0045—01

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）可刺激血管增生、介導(dǎo)炎性反應(yīng)、促進(jìn)纖維細(xì)胞增殖以及膠原合成等。常見(jiàn)的3個(gè)亞型為：TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，本研究主要探索TGF-β2在骨髓纖維化中的表達(dá)特點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

30例確診為繼發(fā)性骨髓纖維化的骨髓組織標(biāo)本設(shè)為實(shí)驗(yàn)組，均未接受放療和化療。正常對(duì)照組24例，為良性血液病無(wú)纖維化的骨髓活組織。樣本均來(lái)自陜西中醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院血液病科門診和住院的患者。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑 冷丙酮固定液， 包埋劑甲液（甲基丙稀酸羥乙基酯單體、聚乙二醇、過(guò)氧化苯甲酰），包埋劑乙液（N -N 二甲基苯甲胺、聚乙二醇）；TGF-β2抗體（由福州邁新生物技術(shù)有限公司提供）。

1.3標(biāo)本制作方法

（1）取材：用骨髓活檢穿刺針（ 3mm×25mm） ，在髂后或髂前上棘采取兩步旋轉(zhuǎn)進(jìn)針?lè)ㄈ〕龉撬杌罱M織標(biāo)本。（2）固定：將骨髓組織用冷丙酮固定液，置于-20℃避光環(huán)境下固定8～24h。（3）浸泡：將固定之骨髓組織放入包埋劑甲液中，置-20℃避光環(huán)境下充分浸透8～24h。（4）包埋：按照甲液：乙液=40：1 之

比例注入包埋盒內(nèi)混勻，置于-20℃避光環(huán)境下待其凝固。（5）制片：制成2～3

μm 組織切片，裱片于用稀釋多聚-L-賴氨酸處理的載玻片上，吹干待用。（6）免疫組化染色：嚴(yán)格按照抗體應(yīng)用說(shuō)明進(jìn)行。

1.4判斷標(biāo)準(zhǔn)

TGF-β2定位于細(xì)胞質(zhì)，在光學(xué)顯微鏡下觀測(cè)，計(jì)數(shù)10個(gè)高倍視野下TGF-β2著色的細(xì)胞比例數(shù)，求出平均值，陽(yáng)性細(xì)胞≤5%為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞> 5%為陽(yáng)性。

2 結(jié)果

對(duì)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的骨髓活檢組織進(jìn)行塑料包埋，制備半薄切片后，進(jìn)行免疫組化染色，檢測(cè)骨髓組織中TGF-β2的表達(dá)，結(jié)果見(jiàn)表1。

行χ2檢驗(yàn)，χ2=8.438，P<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即骨髓纖維化患者骨髓組織中TGF-β2的表達(dá)低于正常對(duì)照組。

3 討論

骨髓纖維化的發(fā)病機(jī)制至今仍然存在爭(zhēng)議，常見(jiàn)的原因包括：造血干細(xì)胞異常、免疫細(xì)胞異常以及各種細(xì)胞因子的異常。其中細(xì)胞因子在骨髓纖維化發(fā)生發(fā)展中的機(jī)制主要有：轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、血小板源性生長(zhǎng)因子以及其他細(xì)胞因子的參與，如成纖維細(xì)胞因子在骨髓纖維化患者外周血中的巨核細(xì)胞以及血小板中呈高表達(dá)，是新生血管形成的誘導(dǎo)物，因此，可通過(guò)抑制成纖維細(xì)胞因子的表達(dá)進(jìn)而抑制新生血管形成[1]。

TGF-β廣泛存在于骨組織中，可由成骨細(xì)胞合成，以自分泌和旁分泌的形式調(diào)控成骨細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)其分化[2]。TGF-β蛋白在酸性環(huán)境中可被激活，在巨核細(xì)胞和血小板中可檢測(cè)到，激活后可刺激成纖維細(xì)胞合成膠原。TGF-β蛋白在慢性特發(fā)性骨髓纖維化患者的單核細(xì)胞、巨核細(xì)胞以及血小板中的表達(dá)增加。通過(guò)對(duì)繼發(fā)性骨髓纖維化患者的研究發(fā)現(xiàn)：TGF-β在外周血以及骨髓組織中的表達(dá)均增高[3]，在體外實(shí)驗(yàn)中，利用源自患者的TGF-β蛋白刺激骨髓成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生較多的Ⅲ型前膠原和網(wǎng)硬蛋白，而Ⅰ型前膠原以及膠原的產(chǎn)生較少。關(guān)于TGF-β在骨髓纖維化膠原合成中的作用研究顯示[4]：在骨髓纖維化動(dòng)物模型中，促血小板生成素所誘導(dǎo)的骨髓纖維化需要TGF-β的參與。將TGF-β基因敲除小鼠以及未進(jìn)行基因敲除的野生型小鼠的骨髓進(jìn)行分離，用攜帶有促血小板生成素基因的慢病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，移植到致死劑量照射小鼠上，結(jié)果顯示：已進(jìn)行骨髓移植的TGF-β基因敲除小鼠以及野生型小鼠的血小板水平均增高，并且都有骨髓增生綜合征的表現(xiàn)。接受源自野生型小鼠骨髓移植的小鼠表現(xiàn)為嚴(yán)重的骨髓纖維化，網(wǎng)硬蛋白和膠原纖維增多，而接受源自TGF-β基因敲除小鼠骨髓移植的小鼠并未發(fā)現(xiàn)骨髓纖維化，并且未檢測(cè)到TGF-β。由此可見(jiàn)，TGF-β在促進(jìn)骨髓網(wǎng)硬蛋白的沉積中具有重要的調(diào)控作用，是骨髓纖維化發(fā)生發(fā)展中的關(guān)鍵調(diào)節(jié)分子。通過(guò)對(duì)TGF-β與骨髓纖維化的關(guān)系研究，可為臨床靶向治療提供依據(jù)，通過(guò)對(duì)系統(tǒng)性硬化病的小雞模型研究[5]發(fā)現(xiàn)：TGF-β1具有促進(jìn)纖維化作用，而TGF-β2和TGF-β3具有抑制纖維化作用，三種亞型之間的平衡調(diào)節(jié)對(duì)纖維化的形成具有重要作用，具體的調(diào)節(jié)機(jī)制還需進(jìn)一步研究去證實(shí)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 胡喜梅， 周水陽(yáng)， 徐洪， 等. 沙利度胺治療原發(fā)性骨髓纖維化臨床療效觀察[J]. 中國(guó)藥物與臨床， 2004， 4（7）： 507-509.

[2] 魏義勇， 石印玉. 轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子β調(diào)控成骨細(xì)胞的分子機(jī)制 [J]. 中國(guó)中 醫(yī)骨傷科雜志， 2003， 11（5）： 58-61.

[3] Shehata M， Schwarzmeier JD， Hilgarth M， et al. TGF-beta1 induces bone marrow reticulin fibrosis in hairy cell leukemia [J]. J Clin Invest， 2004， 113 （5）： 676-685.

[4] Chagraoui H， Komura E， Tulliez M， et al. Prominent role of TGF-beta 1 in thrombopoietin-induced myelofibrosis in mice [J]. Blood， 2002， 100（10）： 3495- 3503.

[5] Sgonc R， Wick G. Pro- and anti-fibrotic effects of TGF-beta In s cleroderma [J]. Rheumatology， 2008， 47（5）： 5-7.