帕金森病大鼠模型紋狀體內(nèi)γ—氨基丁酸 A受體β亞基含量的變化

【摘 要】目的：探討在帕金森病（Parkinson’s disease，PD）狀態(tài)下紋狀體γ-氨基丁酸（gamma amino-butyric acid， GABA） A受體各個(gè)β亞基表達(dá)水平的變化。方法：分離6-羥基多巴（6-OHDA）制作成功的PD動(dòng)物模型和正常SD大鼠的紋狀體，應(yīng)用高效液相（High Performance Liquid，HPLC）法測定紋狀體中GABA的含量，應(yīng)用qRT-PCR的方法檢測紋狀體中GABA A受體中β1亞基、β2亞基和β3亞基的mRNA的表達(dá)水平，應(yīng)用western blot的方法檢測紋狀體中GABA A受體中β1亞基、β2亞基和β3亞基的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)果：根據(jù)皮下注射阿撲嗎啡判定成模的PD大鼠，紋狀體內(nèi)的GABA含量與對(duì)照側(cè)及正常對(duì)照的雙側(cè)相比均下降不是很明顯（P>0.05），但在mRNA的表達(dá)水平上，紋狀體中各個(gè)β亞基表達(dá)水平均有所升高（P<0.05）；各個(gè)亞基的蛋白水平的變化趨勢與mRNA的變化相致。結(jié)論：1. GABAA受體的β1亞基、β2亞基和β3亞基在檢測紋狀體中均有表達(dá)，存在受體共存現(xiàn)象。2. 與GABA在PD動(dòng)物腦組織中含量相適應(yīng)，在PD狀態(tài)下，β1亞基、β2亞基和β3亞基有受體上調(diào)情況。

【關(guān)鍵詞】帕金森??；gama-氨基丁酸；受體；β 亞基

【中圖分類號(hào)】R742 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】1004-7484（2013）10—0003—02

γ-氨基丁酸（ gamma- aminobutyric acid， GABA）是一種天然存在的非蛋白質(zhì)氨基酸，研究表明在基底節(jié)環(huán)路中，GABA能神經(jīng)元廣泛分布于紋狀體、蒼白球內(nèi)、外側(cè)部（internal and external parts of glubus pallidus，GPi and GPe），GABA的受體則分布于蒼白球外側(cè)部（GPe）、丘腦底核（STN）、蒼白球內(nèi)側(cè)部（GPi）、黑質(zhì)網(wǎng)狀部（SNr）和丘腦的腹前核/腹外側(cè)核（VA/VL）。GABA受體包括GABA A、GABA B和GABA C有三個(gè)亞型，其中GABAA受體主要分布于腦內(nèi)，GABA B受體則分布于脊髓和全身各處。GABA C受體主要分布于周圍神經(jīng)系統(tǒng)[1-2]。GABAA受體亞單位的β亞基具有GABA的結(jié)合位點(diǎn)，當(dāng)GABA與突觸后膜的GABA A 受體的β亞基結(jié)合后，使整個(gè)受體產(chǎn)生變構(gòu)作用，打開氯離子通道，達(dá)到抑制突觸后神經(jīng)元的作用[3-4]。由于在PD狀態(tài)下，基底節(jié)環(huán)路中的GABA含量在某些核團(tuán)是升高的，而在其它核團(tuán)是降低的。研究表明，配體濃度的升高或降低，有時(shí)會(huì)影響到突觸后膜上受體含量的變化。那么，在PD狀態(tài)下，在基底節(jié)環(huán)路的核團(tuán)中，GABA A受體的β亞基的含量是否會(huì)隨著GABA含量的變化而發(fā)生適應(yīng)性的變化呢？還沒有明確的報(bào)道。本研究應(yīng)用qRT-PCR和western blot 的方法來檢測GABA A受體的β亞基的分布范圍及表達(dá)量是否存在變化，這種變化也可能會(huì)成為研究PD實(shí)驗(yàn)治療的一個(gè)切入點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 40只SD大鼠 遼寧醫(yī)學(xué)院動(dòng)物中心提供

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 PD動(dòng)物模型的取材

選擇連續(xù)檢測8周后成模的PD模型大鼠和正常SD大鼠，6%水合氯醛深度麻醉后應(yīng)用生理鹽水灌注，轉(zhuǎn)換腦組織中的血液，在冰上迅速分離腦組織，在解剖顯微鏡下分離出紋狀體，稱重備用。

1.2.2 高壓液相色譜分析測定組織勻漿中GABA含量

取稱重好的腦組織，按照1000μl/100mg的量加入勻漿液，充分研磨，4℃，14000rpm離心15分鐘，小心吸出上清至另一新的高壓滅菌后的1.5ml EP管中，再次離心收集上清，用0.45μm濾膜過濾后高壓液相色譜分析法測定勻漿中GABA的含量。

1.2.3 紋狀體中GABAA受體各個(gè)β亞基的表達(dá)

取稱重好的紋狀體，直接放入研缽中，加入少量液氮，迅速研磨，按照1ml/50mg組織的比例加入Trizol，提取總RNA和蛋白質(zhì)，應(yīng)用RT-PCR和western blot 方法檢測GABAA受體β1，β2，β3亞基的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)以 ±s表示，利用SPSS13.0軟件包行方差分析，P<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié)果

2.1 PD動(dòng)物模型的紋狀體中GABA含量的檢測

經(jīng)過高效液相法測定GABA在紋狀體中的表達(dá)水平，可見在紋狀體中，損傷側(cè)的GAGA含量降低，與其它三個(gè)部分相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。

2.2 RT-PCR方法檢測GABAA受體中各個(gè)β亞基的mRNA水平

取PD動(dòng)物模型和正常SD大鼠的紋狀體提取總RNA，經(jīng)過RT-PCR的方法檢測GABAA受體β1亞基、β2亞基和β3亞基的mRNA水平均較，損傷側(cè)β1亞基、β2亞基和β3亞基的mRNA水平均較對(duì)照側(cè)及正常對(duì)照組明顯升高，差異具有顯著性（P<0.05），但β1亞基和β2亞基mRNA水平較低，而β3亞基的mRNA水平較高（詳見表2，圖1）。

2.3 PD大鼠模型中各個(gè)腦區(qū)中GABAA受體各個(gè)β亞基的蛋白表達(dá)水平

取PD動(dòng)物模型和正常SD大鼠的紋狀體提取總蛋白，經(jīng)過western bolt的方法檢測GABAA受體β亞基蛋白在紋狀體中的表達(dá)，經(jīng)過與內(nèi)對(duì)照NADPH的條帶進(jìn)行灰度比對(duì)，獲得相對(duì)的蛋白表達(dá)量。三者與對(duì)照側(cè)紋狀體及正常對(duì)照的雙側(cè)紋狀體相比，表達(dá)量均有所增加（見表3圖2）。相對(duì)來說，β1亞基和β2亞基的表達(dá)在損傷側(cè)紋狀體中與對(duì)照側(cè)紋狀體及正常對(duì)照的雙側(cè)紋狀體與其它三組相比，表達(dá)有所升，差異具有顯著性意義（P<0.05）。而β3亞基的表達(dá)則明顯升高，差異具有顯著性意義（P<0.01）。

3 討論

GABAA受體亞型包括有19種亞單位，包括α1-6， β1-3， γ1-3， δ， ε， π， θ， 和 ρ1-3亞基[5]。其中α亞基與GABAAR的調(diào)節(jié)物結(jié)合（如苯二氮卓類等藥物和巴比妥類藥物），結(jié)合后可以改變受體的構(gòu)象，促進(jìn)受體的β亞基與GABA結(jié)合而產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，GABAA受體至少由一種α、β與γ2組成，其中α2β2γ2分布最廣，在多數(shù)部位也存在受體共存的現(xiàn)象[6]。在本實(shí)驗(yàn)中，無論是從mRNA的水平，還是從蛋白質(zhì)水平，均有證據(jù)表明紋狀體中存在GABAA受體共存的現(xiàn)象。

以往的研究表明，受體的數(shù)量以及受體與激素的親和力可以隨體內(nèi)激素水平而變化：當(dāng)某一激素的與受體結(jié)合，使其受體數(shù)量增加、 親和力增強(qiáng)的現(xiàn)象稱為受體上調(diào)。反之，稱為受體下調(diào)[7-8]。在PD狀態(tài)下，由于紋狀體中多巴胺的含量降低，導(dǎo)致在基底節(jié)神經(jīng)環(huán)路的一些核團(tuán)中神經(jīng)遞質(zhì)的含量發(fā)生了變化，引起PD的癥狀。在本實(shí)驗(yàn)中，檢測了到紋狀體抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA的含量較正常有降低，與此相對(duì)應(yīng)，紋狀體中GABAA受體各個(gè)β亞基的表達(dá)水平表達(dá)有升高，僅有β3亞基升高明顯。存在因神經(jīng)遞質(zhì)含量降低而受體上調(diào)的現(xiàn)象。為今后本課題組在進(jìn)行PD實(shí)驗(yàn)治療方面積累了重要的數(shù)據(jù)。

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