糖結(jié)合疫苗及其免疫干擾的研究進展

【摘要】 細菌性糖結(jié)合疫苗的出現(xiàn)改變了兒童疫苗的應(yīng)用策略。目前應(yīng)用于結(jié)合疫苗的載體蛋白主要有破傷風(fēng)類毒素（tetanus toxoid，TT），白喉類毒素（diphtheria toxid，DT）以及白喉類毒素突變體無毒變異體交叉反應(yīng)物質(zhì)197（Cross-reacting Material 197，CRM197）。研究顯示，以DT為載體的結(jié)合疫苗的免疫原性要弱于另外兩種載體蛋白，以TT為載體蛋白的多價結(jié)合疫苗可降低糖類抗原的免疫原性，而以CRM197為載體的多價結(jié)合疫苗對減弱糖類免疫原性影響較小，但是可引起旁觀者干擾，尤其是對流感嗜血桿菌（Haemophilus Influenzae Type B，Hib）和乙型肝炎（hepatitis B）的免疫反應(yīng)。基于此，只有可避免這些問題的新型載體才能推進兒童免疫規(guī)劃及結(jié)合疫苗的進一步發(fā)展。

【關(guān)鍵詞】 干擾； 結(jié)合疫苗； Hib疫苗

糖蛋白結(jié)合疫苗（conjugate vaccines，CV）對由hib，腦膜炎奈瑟菌及肺炎鏈球菌等導(dǎo)致的嬰幼兒潛在致命性病的預(yù)防起了重要作用。隨著結(jié)合疫苗價數(shù)及其載體蛋白（carrier protein，CP）劑量的提高，結(jié)合疫苗產(chǎn)生免疫干擾的可能性也隨之提高。載體蛋白的應(yīng)用劑量及傳統(tǒng)的CP誘導(dǎo)的表位抑制現(xiàn)象都不能很好地解釋兩種不同的共存CVs的迥異臨床表現(xiàn)[1]，這預(yù)示有其他原因存在。本文對能繼續(xù)影響新CVs發(fā)展的免疫干擾現(xiàn)象的歷史及本質(zhì)進行綜述。

1 結(jié)合疫苗的免疫反應(yīng)干擾機制

1.1 特異性載體對輔助性T細胞（T-cell help，Th cell）的增強作用 預(yù)先或同時激活針對某一CP的T細胞可能會增強連接于該CP上的半抗原的免疫反應(yīng)。例如，對于嬰幼兒，單價C型腦膜炎球菌多糖破傷風(fēng)類毒素結(jié)合疫（meningococcal serogroup C polysaccharide-Tetanus toxoid，MenC-TT CVs）與Hib-TT同時接種時，前者可增強Hib-TT的免疫原性，表現(xiàn)為抗多聚核糖基核糖醇磷酸鹽（polyribosyl-ribitol-phosphate，PRP）抗體滴度幾何均數(shù)的升高[2]。載體對Th細胞的激活次數(shù)及T細胞介導(dǎo)的協(xié)同信號的增多被認(rèn)為是一兩種額外糖TT結(jié)合疫苗的聯(lián)合應(yīng)用或結(jié)合會增強Hib-TT免疫反應(yīng)的原因。一種含有5 μg PRP、10 μg MenC、10 μg MenY的Hib-MenCY-TT結(jié)合疫苗可激起機體產(chǎn)生合適的Hib、MenC及MenY的抗體滴度及抗體滴度幾何均數(shù)。與全細胞的百白破疫苗（diphtheria-tetanus-whole-cell pertussis，DTPw）聯(lián)合應(yīng)用，可增強TT、Hib-TT、MenC的免疫反應(yīng)，這種現(xiàn)象說明 Pw的輔助性作用，但對于DT、MenC-CRM197則沒有增強作用。這種干擾是導(dǎo)致接種DTPa-Hib結(jié)合疫苗后，抗Hib的免疫反應(yīng)減弱的原因，通常被認(rèn)為是一種能導(dǎo)致氫氧化鋁與PRP之間相互作用的理化性質(zhì)。

1.2 載體誘導(dǎo)的抗原表位抑制（Carrier-induced-epitopic suppression，CIES） CIES的傳統(tǒng)解釋是已經(jīng)存在的針對一種CP的免疫反應(yīng)可以抑制連接于此載體上的半抗原或糖類抗原的免疫反應(yīng)，故會減弱后連接著的免疫反應(yīng)。有試驗可發(fā)現(xiàn)與半抗原TT結(jié)合疫苗有關(guān)的CIES，幾種機制可能單獨或同時起作用。已經(jīng)存在的針對載體蛋白的抗體可能會通過免疫位阻現(xiàn)象或者是通過抗原提呈細胞促進其與抗原抗體復(fù)合物的結(jié)合來阻止半抗原特異性B細胞與其受體表位的結(jié)合，從而實現(xiàn)抗載體B細胞減弱抗半抗原B細胞的免疫反應(yīng)。主要的載體特異性記憶B細胞可能會通過免疫競爭來奪獲半抗原特異性B細胞，如Th細胞，并且由載體誘導(dǎo)的調(diào)控T細胞也可能會干擾針對半抗原的免疫反應(yīng)。上述的任一過程都不會誘導(dǎo)出最佳的針對半抗原的抗體及記憶B細胞。通常，這些CIES機制對半抗原結(jié)合疫苗有重要影響，尤其是細菌性莢膜多糖結(jié)合疫苗。

目前，應(yīng)用于人類疫苗中的載體蛋白的潛在性CIES有明顯的不同，其中最顯著的是TT與DT。在人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）與TT或DT結(jié)合的臨床及臨床前研究中，已存的TT抗體會減弱對hCG的免疫反應(yīng)，而DT不存在這種現(xiàn)象。用hCG-DT作為加強苗可以克服與hCG-DT有關(guān)的免疫抑制。同時也對4型肺炎球菌多糖TT結(jié)合疫苗及MenC-TT進行了相關(guān)研究，對于MenC-CRM197及其已存在的載體免疫干擾未做相關(guān)研究。

1.3 旁觀者干擾 TT、DT、CRM197是應(yīng)用最廣的CPs。CRM197是DT的一種突變體，兩者的不同在于片段A的氨基酸殘基。片段A的改變使其酶活性喪失從而無毒。人們認(rèn)為，CRM197與DT構(gòu)造的不同是導(dǎo)致其對B細胞免疫反應(yīng)減弱的原因。CRM197未經(jīng)甲醛處理，因此其Th細胞的表位無法很好暴露，這是作為載體它比DT更好的原因。以TT和DT為載體的結(jié)合疫苗同時應(yīng)用，可能會導(dǎo)致額外的特異性抗原的免疫干擾，例如旁觀者干擾[3-4]。

旁觀者干擾可能會同時或相繼影響未結(jié)合抗原的免疫反應(yīng)[5]?？赡艿臋C制有：（1）競爭淋巴結(jié)內(nèi)有限的可結(jié)合對象如抗原、細胞因子、濾泡樹突狀細胞、活化信號、濾泡狀Th細胞等。（2）Th1、Th2、Th0細胞間平衡及誘導(dǎo)T細胞調(diào)控機制的改變。旁觀者干擾對結(jié)合抗原與未結(jié)合抗原的免疫減弱有顯著不同，這種影響對乙肝病毒及Hib尤為明顯[3]。一種受人關(guān)注的假設(shè)認(rèn)為此種影響源自對Th細胞平衡性的嚴(yán)格要求。例如，包含在百白破無細胞乙肝滅活脊灰Hib結(jié)合疫苗中的乙肝及Hib-TT可受到同時接種的CRM197結(jié)合疫苗的影響[6]，此干擾可能通過DT與CRM197間的T細胞共享來影響其他抗原的。類似的，DT介導(dǎo)的旁觀者干擾可能會在出生時接種的DTPa5所激起的干擾中起作用[7]。當(dāng)出生時接種無細胞白喉（acellular pertussis，Pa3）疫苗，Hib及乙肝病毒抗體及其抗體幾何平均數(shù)會下降[8]。在這個例子中，旁觀者干擾主要通過包含于 DTPa3-HBV-IPV-Hib中的Pa3起作用，從而影響到HBs和Hib。

2 結(jié)合疫苗中細菌多糖與其載體間的干擾

2.1 Hib結(jié)合疫苗 Hib結(jié)合疫苗已經(jīng)廣泛應(yīng)用，大多以TT及CRM197作為載體，其中一劑中多糖或寡糖的含量為10 μg，糖蛋白比大約為1：2[9]。一種Hib與腦膜炎球菌外膜蛋白復(fù)合物組成的結(jié)合疫苗Hib-OMP可激起機體產(chǎn)生特異性免疫反應(yīng)表現(xiàn)為對于嬰幼兒初次接種即可激起強的及持續(xù)性免疫反應(yīng)，但是加強免疫后不會有高的抗體峰出現(xiàn)，這可能與OMP相關(guān)性固有B細胞絲裂原和TRL-2介導(dǎo)的樹突狀細胞活化漿細胞而非記憶B細胞有關(guān)[9]。

盡管Hib-CRM197和Hib-TT結(jié)構(gòu)不同，它們均能激發(fā)嬰幼兒產(chǎn)生T細胞依賴性、可加強的、成熟抗體[9]。

以前從未接種Hib-CRM197或不與DT聯(lián)合接種，機體對Hib-CRM197的免疫反應(yīng)都較弱，這說明了DT相關(guān)性Th細胞是免疫反應(yīng)必需的。對接種Hib-TT和Hib-CRM197的嬰幼兒研究顯示Hib-CRM197要激發(fā)高的Hib抗體滴度需要聯(lián)合應(yīng)用或基礎(chǔ)免疫過DT。然而，新生兒接種DT或TT均會抑制Hib-CRM197與DT的免疫反應(yīng)，對Hib-TT卻有很少或幾乎無免疫抑制。

新生兒免疫接種對照顯示，初免DT或TT一個月后即可提高Hib-CRM197和Hib-TT抗體滴度幾何平均數(shù)，TT主要在4月齡時加強Hib-TT后續(xù)的免疫反應(yīng)。

有趣的是，Hib-TT或Hib-CRM197的載體蛋白與PRP-OMP載體蛋白的結(jié)合可以解釋開始沒有預(yù)料到的Hib結(jié)合疫苗的可交替性。

對于上面描述的免疫干擾機制，DT和TT是不同的，TT傾向優(yōu)先激起載體的免疫反應(yīng)及B細胞載體為主的免疫反應(yīng)，而DT和CRM197主要針對調(diào)控性T細胞而對B細胞反應(yīng)較弱。

2.2 腦膜炎球菌結(jié)合疫苗 單價C型腦膜炎球菌疫苗已與TT或DT成功結(jié)合，一系列多價腦膜炎球菌疫苗如ACWY-DT，ACWY-TT和ACWY-CRM197也在研制之中。盡管IgG是評估疫苗免疫原性的有效輔助手段，目前應(yīng)用于腦膜炎球菌結(jié)合疫苗的評估方法主要有有抗體滴度及血清殺菌活性?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)顯示ACWY-DT是免疫原性最弱的四價結(jié)合疫苗，ACWY-TT和ACWY-CRM197的免疫原性也與其類似[10-11]。這些數(shù)據(jù)與以前有關(guān)HibCVs的一致，這說明DT不是T細胞輔助性免疫的有效成分。

2.3 肺炎球菌結(jié)合疫苗 研究者研制肺炎球菌結(jié)合疫苗使用糖的劑量為1～10 μg，并且使糖蛋白比約為1：2，對于HibCVs顯示出有效性。對于7價或更高價的肺炎球菌疫苗，糖的使用劑量為1～4 μg，明顯低于Hib結(jié)合疫苗10 μg及4價腦膜炎球菌CVs 4～5 μg的糖使用劑量。這種方法上的改變在某種程度上是導(dǎo)致動物實驗使用高劑量糖降低血清特異性免疫反應(yīng)的原因。

已被批準(zhǔn)的7價CRM197 CV使用了比以前所規(guī)定2～5價低的使用劑量，如每種血清型用量為2 μg，6B血清型PCV7-CRM197使用量為4 μg[10]。TT結(jié)合疫苗會降低免疫反應(yīng)，一種包含復(fù)合載體TT、DT的結(jié)合疫苗PCV11-DT/TT CV未被批準(zhǔn)生產(chǎn)[12]。一種包含無血清型HibD蛋白、TT/DT的10價結(jié)合疫苗在幾個國家被批準(zhǔn)生產(chǎn)，命名為SynflorixTM。

3 多價肺炎球菌結(jié)合疫苗中TT與DT或CRM197介導(dǎo)的免疫干擾現(xiàn)象

嬰幼兒使用的4價肺炎球菌TT和DT結(jié)合疫苗，DT和TT的使用劑量明顯不同，6B和23F-DT的劑量是高的，而相同血清型與TT結(jié)合時則降低。這些數(shù)據(jù)與Hib-DT/TT或MenC-DT/TT的數(shù)據(jù)一致，TT主要激活劑量依賴性載體與B細胞載體，而DT則需要增加劑量或Th細胞的激活。

DTP-IPV-Hib應(yīng)用4×10 μg的糖劑量時，四價PCV4-TT結(jié)合疫苗會抑制TT與Hib-TT的免疫反應(yīng)，可見Th細胞的競爭。當(dāng)劑量為4×1 μg時，抑制不會出現(xiàn)。因此，據(jù)后來數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，使用多種載體來克服多價肺炎球菌結(jié)合疫苗干擾的建議是合理的。

PCV8-DT （8×3 μg PS），PCV8-TT （8×1 μg PS）和PCV-11-DT/TT與DTPw共同使用的研究發(fā)現(xiàn)，此聯(lián)合應(yīng)用可誘導(dǎo)出合適的免疫反應(yīng)。而11價混合載體結(jié)合疫苗與DTPa5結(jié)合疫苗聯(lián)合使用時，7種TT結(jié)合疫苗（使用劑量為1 μg）的抗體及抗體幾何平均數(shù)明顯降低，而對于DT（使用劑量為3～10 μg）則不會出現(xiàn)[12]。有關(guān)百日咳的疫苗研究顯示，全細胞百日咳可增強TT的免疫反應(yīng)，而不會增強DT。因此，DTPw中全細胞百日咳的增強作用能避免或克服對TT結(jié)合疫苗的抑制和競爭。DTPw的增強效應(yīng)能導(dǎo)致TT特異性Th細胞的高頻出現(xiàn)，從而避免通過競爭有限Th細胞的陰性干擾及TT特異性T細胞調(diào)控免疫抑制。PCV11結(jié)合疫苗中的四種結(jié)合疫苗不會有競爭及T細胞調(diào)控，這與半抗原DT結(jié)合疫苗及半抗原TT結(jié)合疫苗間臨床前、臨床研究對比一致。

在接種MenC-TT或MenC-CRM197后對C型腦膜炎球菌的反應(yīng)也會有類似現(xiàn)象[2]。令人擔(dān)憂的免疫抑制在高價肺炎球菌結(jié)合疫苗如PCV7-CRM197（含20 μg CRM197）或PCV13-CRM197（29 μg CRM197）沒有出現(xiàn)[13-15]。這又一次揭示TT與DT或CRM197潛在免疫干擾的明顯不同，這種干擾主要通過特異性載體抗體或B細胞或通過T細胞調(diào)控機制實現(xiàn)。

然而，PCV7-CRM197與Hib-CRM197聯(lián)合使用（CRM197總使用量為45 μg）時，肺炎球菌抗體滴度幾何均數(shù)會下降。類似地，PCV9-CRM197與MenC-CRM197聯(lián)合使用（CRM197總使用量為38.5 μg）可降低MenC抗體滴度幾何均數(shù)。因此，結(jié)合疫苗的使用量及CRM197的用量超過一定限度時，就會出現(xiàn)與CRM197有關(guān)的免疫干擾。這表明抗原特性B細胞在結(jié)合疫苗中競爭有限的Th細胞或與調(diào)控機制有關(guān)的載體特異性T細胞。鑒于研究有限，很多現(xiàn)象不能解釋，尤其是分別接種PCV7-CRM197、MenC-CRM197時不會出現(xiàn)針對肺炎球菌及腦膜炎球菌的免疫干擾[16]。

聯(lián)合應(yīng)用PCV7-OMP和Hib-OMP所激發(fā)的6B血清型抗體滴度幾何均數(shù)要比聯(lián)合應(yīng)用PCV7-OMP和Hib-CRM197時低，這表明類似地機制在起作用[17]。

有關(guān)不同的DTPa疫苗與PCV13-CRM197聯(lián)合應(yīng)用的最新研究顯示6B血清型抗體滴度幾何均數(shù)要比與PCV7-CRM197聯(lián)合應(yīng)用時低[13-15]。值得注意的是引起免疫干擾的一種抗原所激起抗體滴度仍然要比無免疫干擾抗原的高。因此，免疫干擾并不一定意味著臨床問題的出現(xiàn)。

6B-CRM197的數(shù)據(jù)顯示了載體應(yīng)用的總劑量與所觀察到的免疫干擾水平間的關(guān)系。血清型6B與23F聯(lián)合應(yīng)用表明6B在應(yīng)用2～3種基礎(chǔ)免疫時表現(xiàn)的更為敏感，使血清型6B成為檢測免疫干擾最敏感的糖類抗原[18]。

第一種用無分型流感嗜血桿菌D蛋白作為載體來替代常規(guī)應(yīng)用載體DT、TT、OMP及CRM197的人類多價肺炎球菌結(jié)合疫苗，是4價11價結(jié)合疫苗。10價結(jié)合疫苗最終決定使用D蛋白作為8種血清型（1、4、5、6B、7F、9V、14、23F）的載體，TT為18C的載體蛋白，DT為19F的。盡管18C-PD和19F-PD對中耳炎的有效性得到證實，但這兩種疫苗有效性的評估及吞噬活性均低于其他血清型疫苗，因此兩種疫苗需要更換載體。血清型3-PD從原來的11價結(jié)合疫苗中去除，因為這種疫苗對急性中耳炎無效性，并且干擾加強免疫[19]。臨床研究顯示與接種3劑PCV7-CRM197相比接種3劑PHiD-CV可激發(fā)機體產(chǎn)生高的抗PRP抗體滴度，可能與18C-TT載體增強Th細胞活性或CRM197介導(dǎo)的旁觀者干擾有關(guān)[19]。

4 總結(jié)

三種常用的CPs（DT，CRM197，TT）在免疫原性及激發(fā)免疫干擾方面有著顯著的不同。與DT相比，TT更易誘導(dǎo)機體出現(xiàn)CIES。為了獲得最佳的免疫反應(yīng)，CRM197結(jié)合疫苗需要與DT聯(lián)合應(yīng)用或進行DT的初免。一般，DT結(jié)合疫苗的免疫原性要比TT及CRM197結(jié)合疫苗的免疫原性差。在兒童疫苗研究中，多價PCV-TT和PCV-DT結(jié)合疫苗的劑量范圍研究顯示劑量范圍效應(yīng)是相對的。這表明與CIES有關(guān)的多種機制共同作用于對于DT、TT及相關(guān)性結(jié)合疫苗的不同劑量范圍。

綜上所述，要理解與多價糖蛋白結(jié)合疫苗有關(guān)的多種干擾機制需要更好的理解糖結(jié)合疫苗免疫反應(yīng)的決定因素，如多種機制可能共同導(dǎo)致疫苗的干擾。數(shù)據(jù)顯示CRM197結(jié)合疫苗聯(lián)合應(yīng)用時會提高免疫干擾的發(fā)生率。因此，在引進一種新的多價結(jié)合疫苗如PCV13-CRM19 和ACWY-CRM197，需要很好地理解臨床應(yīng)用CRM197所引起的干擾及其發(fā)生機制。免疫決策者從而制定具有最大免疫反應(yīng)的免疫規(guī)劃，來保證聯(lián)合疫苗高覆蓋率，從而提高免疫受益。

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（收稿日期：2013-03-18） （本文編輯：歐麗）