不同方法從絞股藍(lán)種子中提取基因組DNA的研究

摘 要：以絞股藍(lán)種子為研究材料，采用改良的CTAB法、改良的SDS法和高鹽低pH法對(duì)絞股藍(lán)基因組DNA進(jìn)行提取，對(duì)提取效果采用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)、瓊脂糖凝膠電泳和RAPD進(jìn)行綜合比較分析。結(jié)果表明：3種提取方法所獲得的DNA，其OD260/OD280多數(shù)都在1.80～2.00，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果也顯示DNA 的質(zhì)量很好，改良的SDS法提取效率顯著好于改良的CTAB法和高鹽低pH法；而且改良的SDS法提取的DNA的RAPD圖譜條帶最亮、最清晰。因此，從DNA產(chǎn)量、質(zhì)量等方面綜合考慮，改良的SDS法為絞股藍(lán)種子DNA提取的有效方法。

關(guān)鍵詞：絞股藍(lán)；基因組；CTAB法；SDS法；高鹽低pH法

中圖分類號(hào) S567 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）18-22-03

絞股藍(lán)（Gynostemmna pentaphullum（Thumb）Makino）為葫蘆科多年生蔓生藤本植物，含有多種皂甙成份、黃酮類物質(zhì)及多種氨基酸、維生素、微量元素等，系統(tǒng)的藥理學(xué)和臨床醫(yī)學(xué)研究證明絞股藍(lán)有抗疲勞、增強(qiáng)免疫力、消除激素類藥物的副作用、降血脂、降血壓、減肥、抗動(dòng)脈粥狀硬化、抗冠心病、健胃增食、改善睡眠、烏發(fā)養(yǎng)顏等多種保健功效[1-3]。

從絞股藍(lán)提取高質(zhì)量DNA是進(jìn)行絞股藍(lán)分子生物學(xué)研究的基礎(chǔ)，而絞股藍(lán)是多年生植物，富含酚類物質(zhì)和多糖，一些常規(guī)DNA提取方法在提取多年生植物材料時(shí)，難于去除多酚雜質(zhì)和多糖，常出現(xiàn)獲得的DNA產(chǎn)量低，質(zhì)量差，產(chǎn)品DNA易降解等問題，有時(shí)甚至不能用作相關(guān)的DNA研究；并且絞股藍(lán)發(fā)芽率低，需經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)才能長(zhǎng)出幼苗。因此，本文選用絞股藍(lán)種子作為研究材料，針對(duì)其具體特點(diǎn)，在常規(guī)的提取方法SDS法[4-5]、CTAB法[6-8]、高鹽低pH法的基礎(chǔ)上進(jìn)行適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)。通過對(duì)提取效果進(jìn)行比較分析，旨在找到一種簡(jiǎn)便、快捷而又經(jīng)濟(jì)的高質(zhì)量絞股藍(lán)種子基因組DNA的提取方法，為絞股藍(lán)DNA多態(tài)性分析及DNA分子輔助選擇研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 絞股藍(lán)種子購置于安康平利縣百草堂科技有限公司絞股藍(lán)種質(zhì)資源圃基地。

1.2 試劑和儀器 CTAB、SDS、EDTA、PVP，Taq酶、dNTP、引物及其他藥品均購于上海生物工程公司。HZS-H水浴振蕩器，UV-2100型紫外可見分光光度計(jì)，GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，TGL-16G臺(tái)式離心機(jī)，恒壓、恒流DF-D電泳儀，UV-ⅥA型紫外透射反射儀。

1.3 提取方法 根據(jù)絞股藍(lán)種子富含多酚多糖等特點(diǎn)，以常規(guī)SDS法、CTAB法和高鹽低pH值法為基礎(chǔ)，稱取100mg絞股藍(lán)種子于預(yù)冷研缽中，加入玻璃砂迅速研磨成細(xì)粉狀后，立即轉(zhuǎn)入1.5mL的滅菌離心，經(jīng)優(yōu)化各提取步驟，得到改良SDS法、改良的CTAB法和改良的高鹽低pH法。

1.3.1 改良的SDS法 （1）裂解。向上述離心管中加入 500μL DNA 提取液（100mmol/L Tris-HCl（pH8.0），50mmol/L EDTA（pH8.0），1%（w/v）PVP-40，1.4mol/L NaCl，用前加β-巰基乙醇至終濃度為2.5%）500μL，混勻后加入80μL 10% SDS，65℃水浴15min（間隔晃動(dòng)3次）。加入100μL 5mol/L KAc，混勻后冰浴30min。

（2）離心。將樣品管于 12 000r/min 離心5 min，離心后將上清液小心轉(zhuǎn)移到吸附柱中，室溫放置2～3 min，12 000 r/min離心1min，離心后將上清液再次轉(zhuǎn)移到同一吸附柱中，12 000r/min 離心 1min，棄廢液。

（3）漂洗。向離心管中加入 500μL 70% 乙醇 ，振蕩起沉淀數(shù)秒鐘，12 000r/min 離心 1min，棄廢液；重復(fù)1次。去上清液后再重復(fù)洗滌沉淀1次。風(fēng)干后溶于適量TE緩沖液。得到的樣品于冰箱-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 改良的CTAB法 （1）裂解。向上述離心管中加入500 μL DNA 提取液（2% CTAB，1.4mol/L的NaCl，20 mmol/L的EDTA，100 mmol/L Tris·Cl，0.1%β-巰基乙醇，pH 8.0），65℃水浴15min（間隔晃動(dòng)3次）。加入100μL 5mol/L KAc，混勻后冰浴30min。

（2）離心。離心管稍冷卻后加入等體積的氯仿/異戊醇（24：1），靜置分層后，在4℃，12 000r/min下離心10min，取上清液加入1/3體積無水乙醇輕微混勻后加入等體積氯仿/異戊醇（24：1）混勻，立即10 000r/min下離心10min，緩慢吸取上清液于1.5mL離心管中，上清液中加入濃度3mol/L的NaAc，2倍體積的無水乙醇，12 000r/min離心10 min，除去上清液。

（3）漂洗。用體積分?jǐn)?shù)70%乙醇洗滌2次，自然晾干后溶于100μL TE，置于-20℃中保存。

1.3.3 高鹽低pH值法 （1）裂解。向上述離心管中加入500μL DNA 提取液（100mM pH4.8 NaAc，50mM pH8.0 EDTANa2，500mM NaCl，2%PVP，1.4%SDS，其pH為5.5），65℃水浴2h。

（2）離心。室溫10 000g離心10min，棄沉淀。加入2/3體積的pH4.8 2.5M KAc，混勻。0℃放置30min沉淀蛋白質(zhì)，棄沉淀。上清液中加入0.6倍體積的-20℃預(yù)冷的異丙醇。溫和混勻后于-30℃放置過夜使核酸充分沉淀，離心收集沉淀。750μL無菌蒸餾水溶解沉淀，并于50℃水浴助溶，離心棄不溶物。上清液中加入0.6倍體積異丙醇，1/10體積3M NaAc（pH5.2），混勻后于10 000g離心10min收集DNA。

（3）漂洗。500μL 70%乙醇洗滌沉淀，空氣干燥5min。溶于40μL 0.1×TE緩沖液中。分裝后存于4℃或-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 DNA的檢測(cè)

1.4.1 DNA純度、產(chǎn)量檢測(cè) 將提取的DNA樣品稀釋后，在Tu-1800spc紫外可見分光光度計(jì)上測(cè)定各樣品在波長(zhǎng)260nm及280nm處的光吸收值。根據(jù)A260/A280比值判斷DNA的純度，并根據(jù)A260計(jì)算DNA產(chǎn)量。

1.4.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè) 取8μL DNA加2μL上樣緩沖液，混勻后在0.7%的瓊脂糖凝膠上電泳，恒壓80V，30min后在紫外透射反射儀上觀察并照相，檢測(cè)DNA的完整度和分子量大小。

1.4.3 RAPD檢測(cè) 參照常規(guī)的PCR反應(yīng)中各成分的量，將絞股藍(lán)RAPD優(yōu)化的初始反應(yīng)體系確定為：反應(yīng)體積25μL，l×PCR buffer，0.4μmol/L隨機(jī)引物S90（AGGGCCGTCT），2mmol/L dNTP，1U Taq酶，2mmol/L MgCl2，50ng模板，用雙蒸水補(bǔ)齊體積至25μL[9]。

擴(kuò)增程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，37℃退火1min，72℃延伸1.5min，循環(huán)40次，最后于72℃延伸7min。產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖電泳，紫外凝膠成像儀上觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同方法提取DNA樣品的純度和產(chǎn)量 3種方法提取得到的DNA A260/A280都大于1.9，A260/A230=2.0，表明有RNA污染，為獲得高質(zhì)量的DNA樣品，在提取獲得的DNA樣品中加入RNase后，提取絞股藍(lán)DNA的效果存在差異，改良的SDS及改良的CTAB法提取的DNA A260/A280=1.8左右，說明樣品基本無RNA污染，高鹽低pH法去除RNA的效果較差。從產(chǎn)量上看，改良的SDS法最高，其次是改良的CTAB法，高鹽低pH法得到的最少。3種提取方法所得DNA樣品的純度和產(chǎn)量見表1。

2.2 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)結(jié)果 由圖1可知，改良的SDS法和改良的CTAB法提取的DNA主條帶都較為清晰，無明顯拖尾現(xiàn)象，說明經(jīng)過干燥保存后DNA仍能保持較好的完整性。而高鹽低pH法經(jīng)過RNA處理后，仍有拖尾現(xiàn)象，由于DNA中的多糖具有粘連性，常與DNA結(jié)合成復(fù)合物，使得DNA分子無法離開點(diǎn)樣孔或電泳速度較慢。點(diǎn)樣孔較亮、DNA電泳速度慢，其樣品所含的多糖較多，反之則較少。改良的SDS法提取DNA電泳主帶較亮且點(diǎn)樣孔基本無異物，說明該方法對(duì)絞股藍(lán)種子中多糖和次生代謝產(chǎn)物的去除效果較好。3種方法從種子中提取的DNA分子均大于2 000bp，能滿足分子實(shí)驗(yàn)的要求。

2.3 RAPD的結(jié)果分析 不同提取方法得到的DNA分別用同一種隨機(jī)引物在同等條件下進(jìn)行RAPD反應(yīng)，從RAPD反應(yīng)產(chǎn)物的電泳圖譜看（圖2），3種方法所得DNA均有反應(yīng)產(chǎn)物。改良的SDS法提取的DNA RAPD反應(yīng)產(chǎn)物條帶多而清晰，改良的CTAB法電泳條帶多但亮度稍弱，高鹽沉淀法RAPD條帶數(shù)量較少且亮度最弱。經(jīng)過重復(fù)試驗(yàn)，改良的SDS法RAPD反應(yīng)重復(fù)性好，可用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究，而高鹽沉淀法重復(fù)性相對(duì)較差，改良的CTAB法重復(fù)性最差。說明后2種方法提取的DNA中含有較多的雜質(zhì)影響了RAPD反應(yīng)的穩(wěn)定性。

3 討論

以種子為材料提取DNA可以不受采樣時(shí)間、地點(diǎn)的限制，也解除了提取DNA過程中需要液氮研磨的麻煩。絞股藍(lán)是多年生植物，種子表面有一層膠質(zhì)，需經(jīng)過特殊處理長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)才能長(zhǎng)出幼苗，且發(fā)芽率低，不能滿足在短時(shí)間內(nèi)提取DNA的需要，因此，在進(jìn)行絞股藍(lán)分子生物學(xué)方面的研究時(shí)，利用種子提取DNA無疑是一條快速、簡(jiǎn)便的途徑。

絞股藍(lán)種子中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)、酚類等次生物質(zhì)，這些多酚類化合物和多糖對(duì)于DNA質(zhì)量的影響是植物分子生物學(xué)研究中最常遇到而又必須解決的問題，由于多糖可以抑制多種酶的活性，因此被多糖污染的總DNA樣品無法用于進(jìn)一步的分子生物學(xué)研究 [10-12]。本研究采用了改良的SDS法、改良的CTAB法和改良的高鹽低pH法從絞股藍(lán)種子中進(jìn)提取DNA。整體看來，改良的SDS法在提取液中加入了1.4mol/L NaCl、1% PVP-40和1%β-巰基乙醇，檢測(cè)結(jié)果表明次生物質(zhì)去除較完全，用氯仿∶異戊醇（24∶1）代替苯酚抽提，降低了苯酚殘存對(duì)DNA質(zhì)量的影響。改良的SDS法用于絞股藍(lán)干種子DNA的提取效果較好。而本實(shí)驗(yàn)中改良的CTAB法與常規(guī)的CTAB法步驟基本一樣，提取液中用β-巰基乙醇代替了PVP，3mol/L NaAc代替了0.3mol/L NaCl，但實(shí)驗(yàn)表明β-巰基乙醇去除酚類和蛋白的作用在提取絞股藍(lán)種子基因組DNA中作用并不明顯，其得到的DNA產(chǎn)量和質(zhì)量均不高，β-巰基乙醇對(duì)絞股藍(lán)多糖的去除效果不明顯的原因還有待于進(jìn)一步研究。從DNA的純度效果和檢測(cè)結(jié)果等綜合比較，高鹽低pH法不適合絞股藍(lán)種子DNA的提取。這與楊松杰[13]所報(bào)道的不一致，可能是兩者所使用的實(shí)驗(yàn)材料不同所致。

經(jīng)電泳分析、紫外檢測(cè)及RAPD分析，發(fā)現(xiàn)改良SDS法最適合絞股藍(lán)種子DNA的提取。表現(xiàn)在提取的DNA含量多、純度高、RNA、蛋白質(zhì)、多糖及酚類物質(zhì)污染極少，擴(kuò)增出RAPD圖譜帶型豐富、清晰。本方法體系的建立，為絞股藍(lán)下一步的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)打下良好基礎(chǔ)，可供各位科研工作者在實(shí)踐中參考.

參考文獻(xiàn)

[1]孫廣利，邊洪榮.長(zhǎng)梗絞股藍(lán)與絞股藍(lán)最新研究進(jìn)展[J].中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2003，3（16）：1 823-1 824.

[2]江波，蘭小中.藥用植物絞股藍(lán)的研究新進(jìn)展[J].西藏科技，2005（12）：152.

[3]岳琳娜，高學(xué)玲，岳鵬翔.絞股藍(lán)有效成分的研究進(jìn)展[J].綜述與述評(píng)，2008（11）：6.

[4]葉金山，溫強(qiáng)，江香梅，等.殼斗科5屬植物基因組DNA提取方法研究[J].江西林業(yè)科技，2008（6）：10-12.

[5]鞏艷紅，劉軍，張健，等.毛豹皮樟的葉片DNA提取及其RAPD引物篩選[J].西北林學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19（4）：35-37.

[6]陳昆松，李方，徐昌杰，等.改良CTAB法用于多年生植物組織基因組DNA的大量提取[J].遺傳，2004，26（4）：1 529-1 531.

[7]高潔，李巧明.羽葉金合歡的DNA提取和SSR引物篩選[J].云南植物研究，2008，30（1）：64-68.

[8]曹慶芹，徐月，馮永慶.等.板栗基因組DNA不同提取方法的比較[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)科學(xué)，2007，23（6）：160-163.

[9]湯潔，劉連生，許娜娜，等.絞股藍(lán)葉片DNA提取方法的比較研究[J].安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，3（3）：445-448.

[10]Green M J，Thompson D A，Mackenzie D J. Easy and efficient DNA extraction from woody plants for the detection of phytoplasmas by polymerase chain reaction[J].Plant Disease，1999，83：482-485.

[11]Kim C S，Lee C H，Shin J S，et al. A simple and rapid method for iso-lation of high quality genomic DNA from fruit tree and conifers using PVP[J]. Nucleic Acids Res，1997，25：1 085-1 086.

[12]黃曉丹，張?jiān)瀑F，應(yīng)鐵進(jìn).高質(zhì)量植物基因組DNA的提取[J].植物生理學(xué)通訊，2006，42（2）：311-314.

[13]楊松杰.藥用植物絞股藍(lán)（Gynostemma Pentaohyllum）多倍體育種研究進(jìn)展[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（6）：134-136.

（責(zé)編：施婷婷）