黃肉甘薯糖蛋白的抗氧化作用研究

摘 要：為深度開發(fā)薯類產(chǎn)品，以黃肉甘薯為材料，探索其糖蛋白的抗氧化作用，以期為甘薯產(chǎn)品的開發(fā)提供一條新的思路。經(jīng)水溶浸提、乙醇沉淀、脫游離蛋白和透析等方法，從甘薯中提取糖蛋白；并研究了其對(duì)O2-˙、·OH和H2O2的清除能力，及其還原能力和對(duì)食用油脂的抗氧化作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：黃肉甘薯糖蛋白對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-˙、Fe-H2O2體系產(chǎn)生的·OH和H2O2具有較高的清除活性，并具有較好的抗食用油脂氧化作用和還原能力。以上活性都與糖蛋白的濃度呈一定的量效關(guān)系，表明黃肉甘薯糖蛋白擁有良好的綜合抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：黃肉甘薯；抗氧化活性；糖蛋白；自由基；還原能力

中圖分類號(hào) S531 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2013）18-18-03

在自然界中，糖蛋白廣泛存在于動(dòng)物、植物和一些微生物中，在生物體內(nèi)以不同形態(tài)存在而發(fā)揮作用，是細(xì)胞間基質(zhì)、細(xì)胞膜、粘液、血漿、激素等的重要組成成分。糖蛋白由糖鏈部分和蛋白部分組成，目前國內(nèi)研究已經(jīng)測(cè)定出甘薯糖蛋白的組成，并對(duì)其性質(zhì)做了初步的研究。糖蛋白通過糖肽鍵將糖鏈和肽鏈兩部分連接起來，糖蛋白是蛋白和糖類共價(jià)結(jié)合的復(fù)合物，其中的糖鏈少則一個(gè)，多有數(shù)百個(gè)[1]。日本的研究人員發(fā)現(xiàn)，甘薯含有豐富的糖蛋白，對(duì)人體有特殊的保護(hù)作用，能維持呼吸道、消化道、漿膜腔和關(guān)節(jié)腔的潤滑和心血管的彈性，預(yù)防脂類物質(zhì)在動(dòng)脈管壁上沉淀而引起的動(dòng)脈硬化，從而減緩了人體器官的衰老速度等。近來，巴西的營養(yǎng)學(xué)專家指出，甘薯糖蛋白具有防治白血病、糖尿病等多種疾病的功效。國內(nèi)的研究結(jié)果也表明，甘薯糖蛋白具有很好的降血脂功能[2]和抗腫瘤作用[3]。甘薯糖蛋白作為具有重要生理活性的天然提取物，在功能食品、藥物制造等方面具有廣闊的應(yīng)用潛力?？勺鳛楣δ苁称返墓δ艹煞謥硎褂?，也可將其進(jìn)一步分離純化后單獨(dú)生產(chǎn)制劑，或者作為其它功能藥物的復(fù)配成分使用。本研究旨在研究甘薯糖蛋白的抗氧化作用，探索甘薯糖蛋白是否是良好的天然抗氧化劑，以期提高甘薯的綜合利用率，為甘薯糖蛋白用于功能食品、藥物制造提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 甘薯：紅皮黃肉，市售。鄰苯三酚、乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）、2–脫氧–D–核糖（DR）、2–硫代巴比妥酸（TBA）、鐵氰化鉀、三氯乙酸（TCA）等均為分析純。主要儀器：DZKW型恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器廠；DHG-9246A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；UV-2000型紫外可見分光光度計(jì)，上海洪福儀器儀表有限公司；5810r型高速冷凍離心機(jī)，德國Eppendorf公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 甘薯糖蛋白的制備 甘薯干→粉碎→過80目篩→稱重→1∶15加水→恒溫提?。?0℃，3h）→過濾除渣→離心（4 000r/min，30min）→上清液濃縮→離心（4 000r/min，30min）→上清加3倍體積的乙醇醇析糖蛋白→離心分離（4 000r/min，30min）→棄上清→蒸餾水溶解沉淀→離心分離（4 000r/min，30min）→取上清、用Sevag法除非糖蛋白（V氯仿∶V正丁醇為4∶1；V樣液∶VSevag試劑為3∶1）→離心（4 000r/min，8min）→取上清透析除雜→濃縮→離心（4 000r/min，30min）→上清液醇析→沉淀干燥→糖蛋白混合物。

1.2.2 清除 O2-˙能力的測(cè)定 采用鄰苯三酚自氧化法[4]，0.1mL不同質(zhì)量濃度（0、75、150、300、600μg/mL）的糖蛋白，加2.4mL 0.05mol/L Tris–HCl緩沖液（pH8.2），混勻后加入0.3mL 7mmol/L的鄰苯三酚，混勻，測(cè)[A325]值（A1），在4min時(shí)加入1滴10mol/L HCl中止反應(yīng)，測(cè)[A325]值（A2）。計(jì)算抑制率：P（%）=（△A0–△A1）/△A0×100，△A=A2–A1。A0為空白吸光度，A1為試樣吸光度。

1.2.3 清除·OH能力的測(cè)定 參照劉主等[4]的方法測(cè)定甘薯糖蛋白清除·OH的能力。在試管中依次加入0.1mL不同質(zhì)量濃度（0、75、150、300、600μg/mL）的糖蛋白，0.4mL磷酸緩沖液（50mmol/L，pH7.5），0.1mL 1.04mmol/L的EDTA溶液，0.1mL 2mmol/L的Vc，0.1mL 10mmol/L的H2O2，0.1mL 1mmol/L的FeCl3和0.1mL 60mmol/L的 DR溶液（對(duì)照不加DR），各管最終體積1.0mL?；靹蛟?7℃溫浴1h后，立即加入1mL 25%（v/v）HCl終止反應(yīng)，再加入1mL 1%TBA顯色，沸水浴反應(yīng)15min，立即冷卻，532nm處比色?！H清除率（%）=[A–（A1–A0）]/A×100。式中，A0為空白吸光度，A為樣品吸光度（不加DR），A1為樣品與DR吸光度。

1.2.4 清除H2O2能力的測(cè)定 參照顏棟美和姚艾東[5]的方法測(cè)定甘薯糖蛋白對(duì)H2O2的清除能力。用磷酸緩沖液（pH7.4）配制10mmol/L的H2O2溶液，取5mL H2O2溶液加入 5mL不同濃度的待測(cè)液，混勻后在248nm處測(cè)其吸光度記為A1，以不加H2O2的試樣溶液吸光度為A2，以不加試樣液的H2O2吸光度為A0。H2O2清除率（%）=[A0–（A1–A2）]/A0×100。

1.2.5 對(duì)食用油脂的抗氧化性試驗(yàn) 采用烘箱貯存法測(cè)定糖蛋白對(duì)食用油脂的抗氧化性[6]。取10mL待測(cè)液，加入燒杯中，加豬油10mL，在60℃恒溫10d。取2g油樣和10mL氯仿，移入碘量瓶中，溶解后，加1mL飽和KI溶液和15mL乙酸，立即加塞，搖均1min，暗處靜置5min。加75mL蒸餾水，用0.01mol/L Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液滴定。以空白作對(duì)照，計(jì)算公式為：過氧化值（PV）=（V–V0）×C/M。式中，PV為滴定1kg油樣所需Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液的量（mol/kg），V0為空白消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL），V為油樣消耗Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液的體積（mL），M為油樣質(zhì)量（g），C為Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液濃度（mol/L）。

1.2.6 糖蛋白還原能力的測(cè)定 參照顏棟美和姚艾東的方法[5]測(cè)定其還原能力。在2.5mL磷酸緩沖液（pH6.6）中加入1%的鐵氰化鉀溶液2.5mL，不同濃度的待測(cè)液2.5mL，混勻后在50℃恒溫20min，加2.5mL 10%的三氯乙酸溶液，混勻后在3 000r/min下離心 10min，取上清液 5mL，加 0.1% FeCl3溶液 1mL和蒸餾水 5mL，在 700nm下測(cè)定吸光值。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃肉甘薯糖蛋白對(duì)O2-˙的清除作用 由圖1可知，在測(cè)定體系中加入黃肉甘薯糖蛋白，隨著甘薯糖蛋白濃度的逐步升高，對(duì)O2-˙的抑制率也逐漸增大。當(dāng)甘薯糖蛋白的質(zhì)量濃度為75和150μg/mL時(shí)，雖有清除鄰苯三酚自氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的O2-˙的能力，但效果不太顯著。當(dāng)黃肉甘薯糖蛋白的質(zhì)量濃度為300μg/mL時(shí)，其對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的O2-˙具有明顯的清除作用；當(dāng)黃肉甘薯糖蛋白的質(zhì)量濃度為600μg/mL時(shí)，其對(duì)鄰苯三酚自氧化反應(yīng)中產(chǎn)生的O2-·具有非常明顯的清除作用。

2.2 黃肉甘薯糖蛋白對(duì)·OH的清除能力 Fenton反應(yīng)生成的·OH能夠氧化降解脫氧核糖，在酸性溶液中加熱生成MDA，MDA與TBA反應(yīng)生成紅色產(chǎn)物，該產(chǎn)物在532nm處有最大吸收峰，在反應(yīng)體系中加入抗氧化劑能夠減少紅色產(chǎn)物的生成。由圖2可知，隨著甘薯糖蛋白加入量的逐步增大，其對(duì)·OH的清除作用也逐步增大。說明黃肉甘薯糖蛋白對(duì)·OH具有明顯的清除作用。

2.3 黃肉甘薯糖蛋白清除H2O2的能力 過氧化氫是細(xì)胞代謝過程中產(chǎn)生的常見活性氧之一，H2O2自身沒有活性，但在細(xì)胞中可進(jìn)一步反應(yīng)產(chǎn)生羥自由基，進(jìn)而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生損傷，具有類似氧自由基的毒副作用。由圖3可知，在特定濃度范圍內(nèi)，隨著黃肉甘薯糖蛋白濃度的逐步升高，對(duì)H2O2的清除率也逐漸增大。當(dāng)甘薯糖蛋白濃度為600μg/mL時(shí)，對(duì)H2O2的清除率可高達(dá)88%，這說明黃肉甘薯糖蛋白對(duì)H2O2具有非常明顯的清除作用。[H2O2抑制率（%）][質(zhì)量濃度（μg/mL）]

圖3 不同質(zhì)量濃度的甘薯糖蛋白清除H2O2的能力

2.4 黃肉甘薯糖蛋白對(duì)食用油脂的抗氧化性測(cè)定 在60℃下，豬油會(huì)發(fā)生氧化，生成的過氧化產(chǎn)物可以和KI發(fā)生反應(yīng)生成I2，I2與淀粉反應(yīng)顯藍(lán)色，I2的生成量越大，顯色越深。利用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)液滴定消耗的Na2S2O3量越多，過氧化值越大，表明試樣在此過程中氧化產(chǎn)生的過氧化物越多。由圖4可知，在一定濃度范圍內(nèi)，隨著黃肉甘薯糖蛋白濃度的不斷增大，供試樣品的過氧化值逐漸減小，說明黃肉甘薯糖蛋白對(duì)食用油脂具有很好的抗氧化性。當(dāng)黃肉甘薯糖蛋白濃度<300μg/mL時(shí)，甘薯糖蛋白對(duì)食用油脂的抗氧化作用比較顯著，而后隨甘薯糖蛋白濃度的增大，其抗氧化作用趨于平緩。

2.5 黃肉甘薯糖蛋白還原能力的測(cè)定 如圖5所示，在測(cè)定體系中隨著黃肉甘薯糖蛋白濃度的逐步升高，其相對(duì)應(yīng)的樣品在700nm處吸光度逐步增大，即還原能力逐漸增強(qiáng)，說明黃肉甘薯糖蛋白是優(yōu)良的電子供體，提供的電子既能使Fe3+還原成Fe2+，又可與自由基結(jié)合形成較惰性的物質(zhì)，從而中斷自氧化連鎖反應(yīng)。當(dāng)甘薯糖蛋白濃度<150μg/mL時(shí)，其還原作用不太顯著；但當(dāng)濃度>150μg/mL時(shí)，其還原能力非常明顯，具有較強(qiáng)的還原能力。還原能力可能與分子中未共用電子對(duì)有關(guān)，其分子結(jié)構(gòu)中未共用電子對(duì)越多，還原能力越強(qiáng)。

3 結(jié)論與討論

本研究表明，甘薯糖蛋白對(duì)鄰苯三酚自氧化產(chǎn)生的O2-˙，F(xiàn)e–H2O2體系產(chǎn)生的·OH和H2O2具有明顯的清除作用，具有較好的抗食用油脂過氧化作用和還原能力。說明甘薯糖蛋白具有較好的綜合抗氧化能力，是一種優(yōu)良的天然抗氧化劑。甘薯糖蛋白對(duì)O2-˙、·OH和H2O2有直接的清除能力，表明該糖蛋白在抗炎、抗腫瘤和防衰老等方面可發(fā)揮作用。目前，國內(nèi)外已將抗氧化檢測(cè)用于抗衰老等功能食品的評(píng)價(jià)，因此黃肉甘薯糖蛋白對(duì)功能食品的研發(fā)具有積極的作用。

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