茶樹EST序列中微衛(wèi)星標記的特征分析及應(yīng)用

摘要：從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲得47 913條茶樹（Camellia sinensis）EST序列，通過Cd-hit-est除去冗余序列后得到26 185條非冗余序列，利用Misa軟件分析后共發(fā)現(xiàn)8 244個微衛(wèi)星標記分布于6 283條EST序列中，平均相隔1.52 kb出現(xiàn) 1個 SSR，EST-SSR序列出現(xiàn)頻率為23. 99%。其中，單、二和三核苷酸重復(fù)為主導(dǎo)類型，占 EST-SSR 總數(shù)的 97.83%。A/T、AG/CT和AAG/CTT作為單、二和三核苷酸的優(yōu)勢重復(fù)基元，分別占所屬類型的92.99%、85.11%和26.99%。利用 Primer 5.0軟件，設(shè)計了76對引物進行多態(tài)性檢測，發(fā)現(xiàn)其中59對引物可以擴增出明顯的條帶，34對引物具有多態(tài)性，多態(tài)性比率高達57.63%，表明茶樹 EST-SSR中的多態(tài)性位點比較豐富，比較適合進行大規(guī)模的 EST-SSR多態(tài)性標記的篩選。

關(guān)鍵詞：茶樹（Camellia sinensis）；EST-SSR；分布特征

中圖分類號：S571.1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6178-04

微衛(wèi)星DNA又稱簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeat，SSR），是基因組中由1～6個核苷酸組成的基本單位重復(fù)構(gòu)成的一段DNA序列。與其他分子標記相比，微衛(wèi)星DNA多態(tài)性高、數(shù)量豐富并重復(fù)性好，而且具有遺傳共顯性、對基因組有很好的覆蓋性和操作簡便等特點[1-3]。根據(jù)SSR標記來源的序列性質(zhì)不同，SSR標記可分為基因組SSR（Genomic SSR，gSSR）和表達序列標簽SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR）兩種。gSSR標記是來源于整個基因組的，而EST-SSR標記則來源于基因組的轉(zhuǎn)錄區(qū)域即表達區(qū)，可以直接反映功能基因的多態(tài)性，為功能基因的直接鑒定提供了可能性，具有通用性更高的優(yōu)點[4]。我國是茶樹（Camellia sinensis）的原產(chǎn)地，茶樹也是我國目前非常重要的經(jīng)濟作物。截至2013年5月，在GeneBank中可獲得47 913條茶樹EST序列， 相比2010年5月時，增加了3倍[5]?；诓铇銭ST序列信息的快速擴增，本研究對已有的茶樹EST序列中SSR信息進行了全面的發(fā)掘，對其組成、特征及分布進行了分析，同時設(shè)計了76對EST-SSR引物，并對19份茶樹樣品材料進行了多態(tài)性分析，從而開發(fā)了可以用于茶樹的EST-SSR標記，為開發(fā)新的茶樹功能基因組SSR標記提供了理論依據(jù)，為建立茶樹EST-SSR標記和探索其在功能基因發(fā)掘、種質(zhì)鑒定、遺傳多樣性分析中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 EST序列的獲得

1.2 EST-SSR的搜索與預(yù)處理

1.3 EST-SSR引物的設(shè)計與合成

1.4 基因組DNA提取與PCR擴增

試驗中所用的19份茶樹樣品材料來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所和湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹與茶葉研究所。采用天根生化科技（北京）有限公司植物基因組DNA提取試劑盒提取每個樣品材料的基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其基因組DNA質(zhì)量，-20 ℃下保存?zhèn)溆?。PCR反應(yīng)體系為15 μL，包括2×PCR Master Mix 7.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各 0.6 μL，基因組DNA 1.0 μL，ddH2O補至15 μL。PCR 反應(yīng)在Bio-Rad S-1000TM PCR儀上進行。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性 4 min；94 ℃變性 30 s，最適退火溫度退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35個循環(huán)；最后 72 ℃延伸 10 min，結(jié)束后將產(chǎn)物置于4 ℃保存。PCR 擴增產(chǎn)物采用 8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測其多態(tài)性，250 V 電泳 2.5 h，電泳結(jié)束后銀染顯色，并記錄。

2 結(jié)果與分析

2.1 EST-SSR分布頻率及特點

47 913條茶樹 EST 序列經(jīng)拼接處理后共獲得26 185 條無冗余、高質(zhì)量的 EST序列。運用Misa軟件對26 185條共12 552 726 bp的非冗余EST序列進行SSR 搜索得到6 283條微衛(wèi)星序列，占 EST總數(shù)的 23.99%。經(jīng)過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，1～6個堿基的排列組合重復(fù)均能被檢出，但各種類型的EST-SSR 出現(xiàn)的頻率數(shù)量大不相同，共有4 153個單核苷酸型SSR、2 935個二核苷酸型 SSR、977個三核苷酸型 SSR、76個四核苷酸型 SSR、41個五核苷酸型 SSR 及 62個六核苷酸型 SSR。

如圖1 所示，從微衛(wèi)星數(shù)目的角度分析，以單核苷酸重復(fù)的數(shù)目最多，占 50.38%；其次是二核苷酸重復(fù)和三核苷酸重復(fù)，分別占 35.60%和11.85%；五核苷酸重復(fù)所占比例最低（0.50%）。單、二和三核苷酸為主要重復(fù)類型，占EST-SSR總數(shù)的97.83%，基元長度大于或等于4的核苷酸重復(fù)所占的比例極小，僅為2.17%。

2.2 EST-SSR 基元類型和比例

從圖2可以看出 ，單核苷酸重復(fù)類型中，A/T重復(fù)頻率最高，占單核苷酸重復(fù)數(shù)目的92.99%；二核苷酸重復(fù)類型中AG/CT重復(fù)數(shù)目最多（2 498個），占二核苷酸重復(fù)數(shù)目的 85.11%，AC/GT和AT/AT重復(fù)頻率相當，沒有出現(xiàn)GC/GC重復(fù)類型；三核苷酸重復(fù)10 種類型中，AAG/CTT重復(fù)頻率最高（26.99%），其次分別是ACC/CTG（21.29%）、ATC/ATG（13.20%），其他7種基元的頻率均不高于10%；四核苷酸重復(fù)類型發(fā)現(xiàn)了14種，除AAAC/GTTT（14.47%）、AAAG/CTTT（23.68%）和AAAT/ATTT（13.16%）外，其他類型重復(fù)出現(xiàn)的頻率均較低，重復(fù)數(shù)目低于10個；五、六核苷酸重復(fù)數(shù)目分別有41個和62個，但是出現(xiàn)次數(shù)都很少，均為個位數(shù)。

2.3 茶樹EST-SSR引物的多態(tài)性分析

利用Primer 5.0軟件，在26 185條 EST序列中隨機選取了其中含有SSR位點的序列進行引物設(shè)計，共設(shè)計了76對EST-SSR引物。利用這76對EST-SSR引物對19份茶樹樣品進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其中59對引物能夠擴增出較清晰的條帶，其余17對引物無明顯條帶，即未能擴增出產(chǎn)物。在可擴增出的較清晰條帶引物中，42對引物的擴增條帶大小與預(yù)期片段大小相近，另外17對引物擴增條帶大小明顯與預(yù)期不符。其中，34對引物能夠擴增出多態(tài)性條帶，多態(tài)性引物占擴增引物的 57.63%，占所有設(shè)計引物的44.74%。圖3為引物A41、A58在19份茶樹樣品中的擴增結(jié)果，把這兩個引物結(jié)合起來足以有效區(qū)分19份茶樹樣品。

3 小結(jié)與討論

本研究對47 913條茶樹 EST序列進行了 EST-SSR特征分析。結(jié)果表明，茶樹EST序列中分布的微衛(wèi)星序列相當豐富，含不同重復(fù)基元SSR的EST序列有6 283條，約占EST序列的13.11%，該篩出率高于已報道的高梁（Sorqhum bicolor L. Moench）（3.6%）、大麥（Hordeum vulgare）（3.4%）和小麥（Triticum aestivum Linn.）（3.2%），表明茶樹EST-SSR標記具有一定的開發(fā)潛力。其中共8 244個EST-SSR序列，平均相隔1.52 kb出現(xiàn)1個SSR，出現(xiàn)頻率明顯高于小麥[7] （1/15.6 kb）、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[8]（1/5.7 kb）、大麥[9]（1/6.3 kb）和楊樹（Populus L.）（1/14.0 kb）[10]等植物，這表明茶樹轉(zhuǎn)錄組中SSR數(shù)量很豐富，這種差異可能與搜索SSR的算法（如參數(shù)設(shè)定）等多種因素有關(guān)。

當4種不同的堿基隨機組合時，將可能分別產(chǎn)生 2、4、10、33、102和350種單、二、三、四、五、六核苷酸重復(fù)[11]。本研究中單核苷酸的2種重復(fù)和三核苷酸的10種重復(fù)均有出現(xiàn)，二核苷酸重復(fù)中僅缺乏GC/GC重復(fù)類型，但大多數(shù)四、五和六核苷酸重復(fù)均未出現(xiàn)，表現(xiàn)出明顯的偏倚性，且每一種重復(fù)類型所占比例也各不相同。單核苷酸重復(fù)是主導(dǎo)類型，其次是二核苷酸和三核苷酸。單核苷酸中A/T出現(xiàn)頻率最高，是所有單核苷酸重復(fù)類型的92.99%。在二核苷酸重復(fù)類型中所占比列最重的是AG/CT，是所有二核苷酸重復(fù)類型的85.11%，沒有出現(xiàn) CG/CG重復(fù)。三核苷酸類型中，AAG/CTT、ACC/CTG和ATC/ATG等排列組合出現(xiàn)頻率比較高，依次所占比列為26.99%、21.29%和13.20%。這與金基強等[5]報道的茶樹 EST-SSR 中的優(yōu)勢重復(fù)類型是一致的。

本研究利用EST序列共設(shè)計了76對 EST-SSR引物，并對19份茶樹樣品進行了檢測分析，共篩選出具有多態(tài)性的SSR引物34對，多態(tài)性引物比例為 44.74%。有17對引物不能進行有效擴增，其原因可能是由于擴增區(qū)段存在較為復(fù)雜高級結(jié)構(gòu)或者是上、下游引物含有內(nèi)含子。綜上所述，茶樹EST-SSR基元重復(fù)類型豐富，多態(tài)性位點也較豐富，因此，獲得的SSR標記具有較高的可用性，對于豐富其分子標記類型及數(shù)量、建立遺傳圖譜及進行比較基因組研究都有重要意義。

參考文獻：

[1] POWELL W，MACHRAY G C，PROVAN J. Polymorphism revealed by simple sequence repeats[J]. Trends Plant Science，1996， 1（7）：215-222.

[2] PARK J S， KIM J B， HAHN B S， et al. EST analysis of genes involved in secondary metabolism in Camellia sinensis（tea），using suppression subtractive hybridization[J]. Plant Sci， 2004，166（4）：953-961.

[3] 周紅偉，姚艷梅，付 忠，等.春性雙低甘藍型油菜雜交種和親本指紋圖譜構(gòu)建及雜交種純度鑒定[J]. 西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2010，19（3）：81-86.

[4] EUJAYL I， SORRELLS M， BANM M， et al. Isolation of EST-derived microsatellite markers for genotyping the A and B genomes of wheat[J]. Theor Appl Genet，2002，104（2）：399-407.

[5] 金基強，崔海瑞，陳文岳，等.茶樹EST-SSR的信息分析與標記建立[J].茶葉科學(xué)，2006（1）：17-23.

[6] LI W Z， GODZIK A. Cd-hit： A fast program for clustering and comparing large sets of protein or nucleotide sequences[J]. Bioinformatics，2006，22（13）：1658-1659.

[7] KANTETY R V， ROTA M L， MATTHEWS D E， et al. Data mining for simple sequence repeats in expressed sequence tags from barley， maize， rice， sorghum and wheat[J]. Plant Mol Biol，2002，48（5/6）：501-510.

[8] CHEN C X， ZHOU P， CHOI Y A， et al. Mining and characterizing microsatellites from citrus ESTs[J]. Theor Appl Genet，2006，112（7）：1248-1257.

[9] THIEL T， MICHALEK W， VARSHNEY R K， et al. Exploiting EST database for the development and characterization of gene-derived SSR markers in barley （Hordeum vulgare L.）[J]. Theor Appl Genet，2003，106（3）：411-422.

[10] CARDLE L， RAMSAY L， MILBOURNE D， et al. Computational and experimental characterization of physically clustered simple sequence repeats in plants[J]. Genetics，2000，156（2）：847-854.

[11] ROTA L R， KANTETY R V， YU J K. Nonrandom distribution and frequencies of genomic and EST-derived microsatellite markers in rice， wheat and barley[J]. BMC Genomics，2005，6（1）：23.