靈芝發(fā)酵豆渣培養(yǎng)條件優(yōu)化

摘要：為了提高豆渣附加值，以豆渣為基質(zhì)固體發(fā)酵赤靈芝[Ganoderma lucidum（Curtis∶Fr） P. Karst]，通過單因素試驗(yàn)研究了發(fā)酵時(shí)間、接種量、培養(yǎng)溫度及蔗糖添加量對(duì)靈芝菌絲生長(zhǎng)和發(fā)酵豆渣多糖含量的影響，并用正交試驗(yàn)優(yōu)化了發(fā)酵條件。結(jié)果表明，蔗糖添加量1.0%、接種量12%、培養(yǎng)時(shí)間12 d、培養(yǎng)溫度27 ℃條件下發(fā)酵豆渣多糖含量最高。

關(guān)鍵詞：赤靈芝[Ganoderma lucidum（Curtis∶Fr） P. Karst]；豆渣；多糖；培養(yǎng)條件

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）24-6135-04

據(jù)統(tǒng)計(jì)，中國每年豆渣產(chǎn)量在2 000萬t左右，如此大量的豆渣利用是一個(gè)難題[1]。研究表明，干豆渣中含20%左右的蛋白質(zhì)，50%左右的膳食纖維素，10%左右的脂肪，以及豐富的鈣、磷等礦物質(zhì)元素和維生素，其中含有的膳食纖維素已被稱為第七種營(yíng)養(yǎng)素，可以預(yù)防結(jié)腸癌、膽結(jié)石、降低膽固醇、預(yù)防由冠狀動(dòng)脈硬化引起的心臟病，降低糖尿病人的血糖水平，是一種優(yōu)質(zhì)的保健食品原料，同時(shí)，豆渣來源廣泛，價(jià)格低，開發(fā)保健食品具有廣泛的應(yīng)用前景[2，3]。為此，以豆渣為固體培養(yǎng)基培養(yǎng)靈芝，研究最佳發(fā)酵條件，為豆制品加工副產(chǎn)物利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

赤靈芝菌種，購于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)食用菌研究中心。豆渣，市售。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的制備 固體培養(yǎng)基：PAD培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，瓊脂17 g，去離子水1 000 mL），分裝于試管，121℃滅菌20 min，擺斜面，備用。

液體培養(yǎng)基：PAD培養(yǎng)基（土豆200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨5 g，KH2PO4 1 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，去離子水1 000 mL），分裝于250 mL三角瓶?jī)?nèi)，120 mL/瓶，121 ℃滅菌20 min，備用。

1.2.2 菌種的制備

1）菌種活化。在無菌條件下，從原始菌種斜面上挑取0.3 cm×0.3 cm大小菌塊，轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)5～7 d，菌絲長(zhǎng)滿斜面后備用。

2）液體種子的制備。在液體培養(yǎng)基中接入3塊黃豆粒大小的赤靈芝活化菌種，于150 r/min旋轉(zhuǎn)式搖床30 ℃培養(yǎng)5 d，備用。

3）赤靈芝發(fā)酵豆渣工藝流程。新鮮豆渣→復(fù)配→滅菌→冷卻→接種→發(fā)酵。將50 g豆渣裝入100 mL的三角瓶中，壓實(shí)，121 ℃下滅菌20 min，冷卻后無菌條件下接種。

1.2.3 豆渣發(fā)酵條件的優(yōu)化

1）豆渣發(fā)酵條件的單因素試驗(yàn)。①蔗糖添加量對(duì)豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗(yàn)。分別稱取0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75、2.00 g蔗糖，加入50 g鮮豆渣中，混勻，即蔗糖添加量分別為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%，控制溫度27 ℃，接種量8%，培養(yǎng)10 d，通過感官評(píng)價(jià)及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳蔗糖添加量；②接種量對(duì)豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗(yàn)。吸取1、2、3、4、5、6 mL的菌液于滅過菌的豆渣培養(yǎng)基中，即接種量分別為2%、4%、6%、8%、10%、12%，培養(yǎng)溫度27 ℃，蔗糖添加量2%，培養(yǎng)10 d，通過感官評(píng)價(jià)及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳接種量。③培養(yǎng)溫度對(duì)豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗(yàn)。在蔗糖添加量2%，接種量8%，培養(yǎng)溫度分別設(shè)定為21、24、27、30、33℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)10 d，通過感官評(píng)價(jià)及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳溫度；④發(fā)酵時(shí)間對(duì)豆渣發(fā)酵品質(zhì)的影響試驗(yàn)。蔗糖添加量2.0%，培養(yǎng)溫度27 ℃，接種量為8%，發(fā)酵時(shí)間分別為4、6、8、10、12、14 d，通過感官評(píng)價(jià)及多糖含量確定豆渣發(fā)酵的最佳接種量。

2）豆渣發(fā)酵最佳條件正交試驗(yàn)。試驗(yàn)根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，通過4因素3水平的正交試驗(yàn)（表1）分析比較發(fā)酵豆渣中多糖含量，確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.4 指標(biāo)測(cè)定

1）發(fā)酵豆渣的感官評(píng)定方法。主要針對(duì)其外觀、質(zhì)地及風(fēng)味3個(gè)方面屬性進(jìn)行評(píng)定（表2）。計(jì)算公式：感官評(píng)定得分=外觀得分×0.4+質(zhì)地得分×0.3+氣味得分×0.3。

2）多糖含量測(cè)定。①葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定。精密量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL的100 mg/L標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液分別置于15 mL的試管中，加去離子水補(bǔ)足1.0 mL，分別加入5%的苯酚1.0 mL，然后快速加入5.0 mL硫酸（與液面垂直加入，勿接觸試管壁，以便與反應(yīng)液充分混合），靜置10 min。使用渦旋振蕩器使反應(yīng)液充分混合，然后將試管置于30 ℃環(huán)境中反應(yīng)20 min，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。②樣品測(cè)定。稱量樣品5 g，精確到0.001 g，置于100 mL的三角瓶?jī)?nèi)，第一次提取料液比為1∶6（m/V，g∶mL，下同），提取2 h，離心分離后再按料液比1∶4加入去離子水提取2 h，合并兩次提取液。吸取提取液0.5 mL加入3倍體積的95%的乙醇混合，靜置過夜以沉淀粗多糖，然后于10 000 r/min離心10 min，棄去上清液。不溶物用1.5 mL的去離子水洗滌溶解，待測(cè)。吸取0.1 mL待測(cè)樣品，按上述步驟操作，測(cè)A490 nm，以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 發(fā)酵條件對(duì)發(fā)酵豆渣感官質(zhì)量的影響 由圖2可以看出，發(fā)酵溫度、接種量、蔗糖添加量和培養(yǎng)時(shí)間對(duì)豆渣的發(fā)酵都有影響，發(fā)酵溫度在27 ℃時(shí)靈芝菌絲粗壯細(xì)密，感官評(píng)價(jià)最好，溫度過低菌絲生長(zhǎng)速度慢，溫度過高菌絲生長(zhǎng)細(xì)弱，容易液化；接種量越大菌絲生長(zhǎng)速度越快，但是接種量加大，發(fā)酵體系中水分含量和糖含量會(huì)增加，試驗(yàn)表明接種量為10%比較合適；蔗糖添加量對(duì)菌絲影響較大，添加0.50 g蔗糖菌絲生長(zhǎng)最好，隨添加量增大，發(fā)酵豆渣感官評(píng)價(jià)值降低，可能與蔗糖增加發(fā)酵體系滲透壓加大，不利于菌絲生長(zhǎng)，再者，蔗糖添加量增大發(fā)酵體系酸堿度降低，從而不利于菌絲生長(zhǎng)；培養(yǎng)時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆渣也有影響，時(shí)間過短，豆渣發(fā)酵不充分。

2.1.2 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵豆渣多糖含量的影響 由圖3可知， 蔗糖添加量對(duì)發(fā)酵豆渣多糖含量影響不大，不同處理豆渣多糖含量大多在8.00%～11.00%，各處理之間差異不顯著，因此選擇添加量為1.0%作為豆渣發(fā)酵優(yōu)化試驗(yàn)添加量。

2.1.3 接種量對(duì)發(fā)酵豆渣多糖含量的影響 由圖4可知，在接種量2%～8%時(shí)隨接種量增加，發(fā)酵豆渣中多糖含量增大，繼續(xù)增加接種量發(fā)酵豆渣中多糖含量趨于平穩(wěn)，可能的原因是接種量低豆渣中靈芝菌絲體生長(zhǎng)速度慢，發(fā)酵豆渣中纖維素分解速度也慢，多糖含量較低，隨接種量增加，發(fā)酵豆渣培養(yǎng)基中靈芝菌絲生長(zhǎng)速度增加，在接種量達(dá)10%左右時(shí)趨于平穩(wěn)。

2.1.4 溫度對(duì)發(fā)酵豆渣多糖含量的影響 由圖5可知， 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵豆渣中多糖含量影響較大，主要原因與發(fā)酵豆渣中靈芝菌絲有很大關(guān)系，培養(yǎng)溫度低，菌絲生長(zhǎng)速度慢，同時(shí)，高溫會(huì)抑制靈芝菌絲的生長(zhǎng)，與感官評(píng)價(jià)的結(jié)果比較一致。

2.1.5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵豆渣多糖含量的影響 由圖6可知，隨發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)，發(fā)酵豆渣中多糖含量總體呈先升高后降低的趨勢(shì)，在接種后的8 d發(fā)酵豆渣中多糖含量最高，然后降低，趨勢(shì)與菌絲生長(zhǎng)情況比較一致，4 d時(shí)發(fā)酵時(shí)間短，菌絲未吃透，12 d以后菌絲衰敗，出現(xiàn)液化現(xiàn)象。

2.2 豆渣發(fā)酵條件的優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，影響發(fā)酵豆渣多糖含量的因素主次順序依次為蔗糖添加量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間、接種量，優(yōu)化得到的豆渣發(fā)酵制備靈芝多糖最佳條件為蔗糖添加量1.0%，接種量12%，發(fā)酵時(shí)間12 d，培養(yǎng)溫度27 ℃，通過優(yōu)化，發(fā)酵豆渣中多糖含量達(dá)10.41%，為未發(fā)酵前的1.9倍。

3 討論

豆渣是制備豆腐、豆?jié){等的副產(chǎn)物，每年的量都很大，據(jù)統(tǒng)計(jì)，每加工1 kg大豆會(huì)產(chǎn)生2 kg的豆渣，以此推斷中國每年的豆渣產(chǎn)量在2 000萬t以上。豆渣因具有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，所以鮮豆渣利用一直是世界難題[4，5]。豆渣中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量能夠滿足藥用真菌的生長(zhǎng)要求。丁玉萍等[6]以豆渣為主要原料，應(yīng)用正交試驗(yàn)法對(duì)香菇液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，香菇液體發(fā)酵最佳培養(yǎng)基配方為葡萄糖2%，MgSO4 0.05%，豆渣9%，KH2PO4 0.1% ，并用洗渣水替代水配料；適宜的發(fā)酵條件為發(fā)酵時(shí)間6 d，裝液量250 mL三角瓶裝液80 mL，發(fā)酵溫度25 ℃。靈芝是公認(rèn)的具有提高免疫力、抗腫瘤活性的藥用真菌，其含有的靈芝多糖等物質(zhì)具有安神、提高免疫力等作用[7]。傳統(tǒng)獲取靈芝多糖的方法是用靈芝子實(shí)體進(jìn)行提取，提取過程需要消耗大量的熱能和水，而提取率一般在2%以下，提取成本很高[7，8]。研究結(jié)果表明，采用豆渣發(fā)酵制備靈芝多糖是獲取靈芝多糖的有效方法，發(fā)酵豆渣中多糖含量可達(dá)10%以上，而且具有豆渣原料便宜、發(fā)酵時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)酵豆渣培養(yǎng)靈芝獲得的多糖與靈芝子實(shí)體中多糖在結(jié)構(gòu)和功能上的區(qū)別還需要進(jìn)一步研究。

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