鴿源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及毒力因子分析

摘要：通過從活禽市場上取鴿子泄殖腔拭子，分離鑒定了4株空腸彎曲桿菌（Campylobater jejuni）菌株，PCR調(diào)查發(fā)現(xiàn)，4株菌株均具有細胞膨脹毒素等9個重要的毒力相關(guān)因子。選取其中2株進行毒力基因序列分析，序列比對結(jié)果顯示該鴿子源空腸彎曲桿菌的毒力基因序列與已測序的同時從人和禽屠宰場中分離到的空腸彎曲桿菌M1株的毒力基因相似度最高。

關(guān)鍵詞：鴿子；空腸彎曲桿菌（Campylobater jejuni）；毒力因子

中圖分類號：S831 文獻標(biāo)識碼：B 文章編號：0439-8114（2013）24-6120-04

彎曲桿菌病（Campylobater jejuni）是在世界范圍廣泛流行的人獸共患病，該病引起成人和兒童腹瀉，已經(jīng)成為危害食品安全的重要食源性疾病，其病原主要為空腸彎曲桿菌（Campylobacter jejuni）等彎曲桿菌屬的細菌[1]。空腸彎曲桿菌宿主范圍廣，是野生、家養(yǎng)動物的正常寄居菌，在腸道內(nèi)有大量細菌，感染的動物通常無明顯病癥，但可長期向外界排菌，通過排泄物或分娩污染食物和飲水，從而引起人類感染[2]。

鴿子也是空腸彎曲桿菌的自然宿主之一，隨著鴿子越來越多的被人工飼養(yǎng)，并擺上餐桌或者成為寵物，鴿子也成為人感染彎曲桿菌病病原潛在的中間宿主。本研究從活禽市場上取鴿子泄殖腔拭子分離鑒定到4株空腸彎曲桿菌菌株，并進行了毒力基因和毒力相關(guān)基因的分析，認(rèn)為本次活禽市場上分離的空腸彎曲桿菌具有感染人類的潛在威脅。

1 材料與方法

1.1 菌株

C. jejuni ATCC 33291菌株購自中國菌種保藏中心，該菌分離自人的糞便。臨床分離菌株由動物胚胎工程及分子育種湖北省重點實驗室分離保存。

1.2 試劑與儀器

用于空腸彎曲桿菌分離培養(yǎng)和增菌的改良CCD瓊脂（mCCDA）培養(yǎng)基和布氏肉湯培養(yǎng)基購自青島海博生物技術(shù)有限公司。厭氧培養(yǎng)罐和微需氧產(chǎn)氣袋購自O(shè)XOID公司，rTaq酶、dNTPs、DNA maker購自寶生物（大連）工程有限公司。DNA瓊脂糖膠回收試劑盒購自Axygen公司。細菌基因組提取試劑盒購自O(shè)mega公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌株的分離 在活禽市場隨機取鴿子泄殖腔拭子標(biāo)本50份，直接劃線接種于mCCDA平板，在微需氧環(huán)境下培養(yǎng)48～72 h，觀察菌落特征，挑取可疑菌落進行革蘭氏染色鑒定，利用顯微鏡進行形態(tài)觀察，并進一步進行分離純化。

1.3.2 DNA模板的制備 在mCCDA平板上挑取培養(yǎng)的空腸彎曲桿菌單菌落，經(jīng)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)增菌后，使用細菌基因組提取試劑盒提取空腸彎曲桿菌的基因組，詳細步驟見試劑盒說明書。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的分離與鑒定結(jié)果

取鴿子泄殖腔拭子劃線分離，經(jīng)過純化后觀察到4株空腸彎曲桿菌疑似菌株，分別命名為G2-14、G2-19、G2-20、G2-31，該菌在mCCDA平板上觀察到扁平、灰色、濕潤、有光澤、呈沿線擴散生長且邊緣不規(guī)則的菌落，經(jīng)革蘭氏染色后該菌呈紅色，為革蘭氏陰性菌株，菌株較其他常見腸道菌如大腸桿菌、沙門氏菌的小，形態(tài)細長，呈彎曲狀或海鷗狀，與購買的空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株形態(tài)一致。

2.2 菌株的16 S rRNA測序鑒定結(jié)果

分離菌株使用細菌擴增16 S rRNA的通用引物成功擴增出長度約為1 500 bp的DNA片段，測序后結(jié)果與空腸彎曲桿菌的16 S rRNA序列100%同源，證明分離的菌株G2-14與G2-31為空腸彎曲桿菌。

2.3 毒力相關(guān)基因的鑒定

選取G2-19、G2-31和空腸彎曲桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株C. jejuni ATCC 33291，使用9對引物分別擴增了毒力因子或毒力相關(guān)因子（cdtA、cdtB、cdtC、ciaB、cheY、cadF、peb1、fliA和flaA）的部分片段，如圖1所示，片段大小均與預(yù)期相符，2株分離的空腸彎曲桿菌和購買的標(biāo)準(zhǔn)菌株均編碼有這些毒力基因或毒力相關(guān)基因。

2.4 毒力基因的序列分析

為了進一步分析菌株之間的差異，將以上擴增的毒力基因或毒力相關(guān)基因片段進行測序，并將測序結(jié)果與已經(jīng)全基因組測序的空腸彎曲桿菌菌株相關(guān)序列進行比對，比對菌株包括人源菌株C. jejuni NCTC 11168、C. jejuni 81-176、C. jejuni 81116、C. jejuni M1、C. jejuni ICDCCJ07001，雞源菌株C. jejuni RM1221、C. jejuni S3，羊源菌株C. jejuni IA3902和C. jejuni PT14。其中C. jejuni M1同時在病人和家禽屠宰場分離到，為家禽到人類的傳播提供了直接證據(jù)[4]。比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)各菌株flaA基因序列差異較大，其余各個毒力相關(guān)基因序列相似性都達到90%以上，其中部分基因非常保守，如cheY，但是其他基因還是存在一定堿基的差異。其中分離菌株G2-14、G2-31和C. jejuni M1相似度最高，如表3所示，除flaA以外，相似度均達到99%以上，對序列進行聚類分析顯示，分離菌株G2-14、G2-31和C. jejuni M1均聚為一類，尤其是cdtB、cdtC和fliA基因，G2-14、G2-31、C. jejuni M1達到100%一致（圖2），而與其他大部分測序的菌株均呈現(xiàn)出多個位點的堿基差異。

3 小結(jié)與討論

彎曲桿菌病已經(jīng)成為造成人類腹瀉的重要病因之一，其中空腸彎曲桿菌是最為重要的病原，該菌宿主范圍較廣，覆蓋雞、鴨等禽類動物以及豬、牛等哺乳動物，肉制品污染彎曲桿菌已經(jīng)成為人類感染彎曲桿菌病的重要原因[5]。以往的研究中采集雞、鴨等樣品，分離到大量的彎曲桿菌[6]，本研究從活禽市場鴿子泄殖腔拭子樣本中分離到空腸彎曲桿菌，說明活禽市場中鴿子也是重要的空腸彎曲桿菌攜帶源，提示在飼養(yǎng)或者食用鴿子的過程中，也要做好彎曲桿菌的防范工作。

空腸彎曲桿菌致病主要包括了4個步驟：黏附上皮細胞、定植消化道、侵入靶細胞和產(chǎn)生與釋放毒素[3，7]。在這個過程中，一系列毒力因子和毒力相關(guān)因子發(fā)揮了重要作用。fliA基因編碼了鞭毛合成蛋白，調(diào)控了細菌的運動性、蛋白分泌和細胞黏附與侵入是影響細菌毒力的重要因子[8]；cdtABC編碼了空腸彎曲桿菌惟一的毒素——細胞致死膨脹毒素，被認(rèn)為是主要的致病相關(guān)因子[9]。ciaB編碼彎曲桿菌侵入抗原[10]，cadF編碼牽連蛋白[11]，peb1編碼周質(zhì)結(jié)合蛋白，它們均與細菌的黏附和侵入相關(guān)[12]，cheY編碼調(diào)控鞭毛運動的調(diào)控子[13]， flaA也同樣是重要的毒力相關(guān)因子，缺失這些基因后均導(dǎo)致細菌毒力顯著降低[14]。毒力因子調(diào)查顯示分離的鴿子源空腸彎曲桿菌G2-19、G2-31同樣具有這些重要的毒力因子或毒力相關(guān)因子。基因序列分析發(fā)現(xiàn)，G2-19、G2-31的fliA和cdt毒素基因序列和C. jejuni M1高度相似。

Friis等[4]同時在人和家禽屠宰場中分離到C. jejuni M1菌株，為空腸彎曲桿菌的禽傳人提供了直接的證據(jù)，全基因組測序后，與其他測序的空腸彎曲桿菌比對發(fā)現(xiàn)，該菌具有很多特異的雞內(nèi)定植相關(guān)的基因。本研究發(fā)現(xiàn)，鴿子中分離的空腸彎曲桿菌G2-19、G2-31與C. jejuni M1菌株毒力基因序列最為相似，暗示著該菌株也具有禽和人之間傳播和交叉感染的能力，對人類的身體健康具有潛在的威脅。在后續(xù)的試驗中將進一步通過動物試驗研究分離的菌株對家禽和哺乳動物的致病性。

參考文獻：

[1] 吳蜀豫，張立實，冉 陸.彎曲菌及彎曲菌病的流行現(xiàn)狀[J]. 中國食品衛(wèi)生雜志，2004，16（1）：58-61.

[2] 吳 潤，劉 崗，佘世紅.人和畜禽的空腸彎桿菌分離培養(yǎng)及帶菌狀況調(diào)查[J].中國獸醫(yī)科技，2000，30（1）：12-15.

[3] DASTI J I，TAREEN A M，LUGERTR， et al. Campylobacter jejuni： A brief overview on pathogenicity-associated factors and disease-mediating mechanisms [J]. International Journal of Medical Microbiology，2010，300（4）：205-211.

[4] FRIIS C， WASSENAAR T M， JAVED M A，et al. Genomic characterization of Campylobacter jejuni strain M1[J]. Plos One，2010，5（8）：12253-12264.

[5] 吳忠亮，朱建國，侯建軍，等.空腸彎曲桿菌在感染雞、豬體內(nèi)分布檢測[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2008，24（9）：890-891.

[6] 黃 武，饒 雷，張 凱，等. 禽源空腸彎曲桿菌的分離鑒定及其致病性的初步研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，2013，40（5）：173-176.

[7] 倪宏波，劉思國.空腸彎曲桿菌及其致病機制研究進展[J]. 中國人獸共患病學(xué)報，2010，26（10）：970-973.

[8] CARRILLO C D， TABOADA E，NASH J H， et al. Genome-wide expression analyses of Campylobacter jejuni NCTC11168 reveals coordinate regulation of motility and virulence by flhA[J]. Journal of Biological Chemistry，2004，279（19）：20327-20338.

[9] PICKETT C L， WHITEHOUSE C A. The cytolethal distending toxin family [J]. Trends Microbiol，1999，7（7）：292-297.

[10] RIVERA-AMILL V， KIM B J， SESHU J，et al. Secretion of the virulence-associated Campylobacter invasion antigens from Campylobacter jejuni requires a stimulatory signal[J]. J Infect Dis，2001，183（11）：1607-1616.

[11] KONKEL M E， GARVIS S G， TIPTON S L， et al. Identification and molecular cloning of a gene encoding a fibronectin-binding protein （CadF） from Campylobacter jejuni[J]. Molecular Microbiology，1997，24（5）：953-963.

[12] PEI Z， BLASER M J. PEB1，the major cell-binding factor of Campylobacter jejuni， is a homolog of the binding component in Gram-negative nutrient transport systems[J].Journal of Biological Chemistry，1993，268（25）：18717-18725.

[13] YAO R J， BURR D H，GUERRY P. CheY-mediated modulation of Campylobacter jejuni virulence[J]. Molecular Microbiology，1997，23（5）：1021-1031.

[14] HENDRIXSON D R. A phase-variable mechanism controlling the Campylobacter jejuni FlgR response regulator influences commensalism[J].Molecular Microbiology，2006，61（6）：1646-1659.