五色梅葉內(nèi)生真菌YJ—11的分離鑒定及其抑菌活性

摘要：從廣東藥用植物五色梅（Lantana camara L.）葉片中分離到一株內(nèi)生真菌YJ-11，通過顯微形態(tài)特征觀察鑒定屬于青霉屬（Penicillium sp.）。液態(tài)靜置培養(yǎng)后，進行有效成分提取，獲得其菌絲體甲醇提取物和發(fā)酵培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物。體外抑菌試驗結果表明，兩種提取物對供試細菌金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu）均具顯著抑菌活性。

關鍵詞：五色梅（Lantana camara L.）葉片；內(nèi)生真菌；青霉屬（Penicillium sp.）；抑菌活性

中圖分類號：Q939.96；R93 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6048-03

自從1929年弗萊明發(fā)現(xiàn)青霉素以來，微生物活性代謝產(chǎn)物成為藥物的豐富源泉，現(xiàn)代幾乎所有臨床應用的抗生素都來源于微生物。近年隨著新病原菌和新病毒的不斷出現(xiàn)，癌癥和心血管病的不斷增加，特別是隨著藥物的濫用，導致病原微生物產(chǎn)生了抗藥性，人們迫切需要尋找到新的療效顯著而毒副作用小的天然藥物。植物內(nèi)生菌[1]生活在植物組織內(nèi)部，與宿主協(xié)同進化，二者形成了互惠關系，一方面植物為內(nèi)生菌提供光合作用產(chǎn)物和礦物質(zhì)，另一方面內(nèi)生菌的代謝物能刺激宿主植物的生長發(fā)育，增強宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力。內(nèi)生菌不僅能夠參與植物次生代謝物的合成或?qū)χ参锎紊x物進行轉(zhuǎn)化，而且還能夠獨立產(chǎn)生豐富的次生代謝產(chǎn)物。Stierle等[2]報道從太平洋短葉紅豆杉（Taxus brevifolia）樹皮中分離到的內(nèi)生真菌Taxomyces andreanae能產(chǎn)生抗癌活性物質(zhì)紫杉醇。Strobel等[3]發(fā)現(xiàn)植物內(nèi)生真菌Gliocladium roseum（NRRL 50072）可以產(chǎn)生生物柴油。植物內(nèi)生菌已引起研究者們的極大興趣[4-7]，并寄希望于從中發(fā)現(xiàn)具有特殊功能、療效顯著、毒副作用小的新穎藥物先導物。

五色梅（Lantana camara L.）[8]又名馬纓丹，為馬鞭草科（Verbenaceae）馬纓丹屬（Lantana）植物，原產(chǎn)美洲熱帶，中國南北都有引種栽培，以廣東、福建、臺灣、浙江、云南、四川等地為多，華南地區(qū)的荒郊野外多有大量分布。其根、莖、葉、花可作中藥用，具有清熱解毒、散結止痛、祛風止癢之功效；葉煎湯洗治濕疹、疥癩毒瘡、皮炎、皮膚瘙癢、臃腫，搗爛敷患處能治跌打筋傷。研究表明，五色梅提取物具有抗菌、抗病毒、消炎、抗腫瘤等生物活性，其主要有效化學成分為三萜類和黃酮類化合物[9-11]，但鮮有關于五色梅內(nèi)生菌研究的報道。本研究在對五色梅植物化學成分研究的基礎上[12-14]，對五色梅內(nèi)生真菌進行了分離，通過顯微鏡形態(tài)特征觀察鑒定并篩選到一株內(nèi)生真菌YJ-11，研究了其粗提物的抑菌活性，為進一步研究開發(fā)該菌奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 五色梅枝條，2011年10月采自佛山科學技術學院北院校區(qū)，采后10 min內(nèi)帶回實驗室進行內(nèi)生真菌的分離。

1.1.2 供試病原菌 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureu），由佛山科學技術學院微生物學教研室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基 抗生素PDA培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的分離純化，其組成為PDA培養(yǎng)基（國產(chǎn)BR級）40 g、鏈霉素200 mg和水1 000 mL，用NaOH調(diào)pH至7。GYP培養(yǎng)基用于內(nèi)生真菌的液體培養(yǎng)，其組成為葡萄糖10 g， 蛋白胨2 g，酵母浸膏1 g，水1 000 mL，用NaOH調(diào)pH至7。LB培養(yǎng)基用于細菌液體培養(yǎng)，其組成為胰蛋白胨10 g 、酵母提取物5 g、氯化鈉10 g，水1 000 mL，調(diào)節(jié)pH至7.4。肉湯瓊脂培養(yǎng)基用于細菌固體培養(yǎng)，其組成為營養(yǎng)瓊脂（普通肉湯瓊脂培養(yǎng)基）4 g，水100 mL。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌的分離純化 取五色梅葉用清水洗凈， 70%乙醇溶液沖洗30 s，無菌水沖洗2次，置于0.2%氯化汞溶液中浸泡30 min，無菌水沖洗6次，無菌濾紙吸干水。在無菌條件下將五色梅葉剪成小片，置于抗生素PDA培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng) 3～7 d，待真菌從組織塊邊緣長出后，挑取菌絲轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基進行純化培養(yǎng)。反復轉(zhuǎn)接純化直到菌落形態(tài)一致，得到純培養(yǎng)菌株YJ-11。PDA試管斜面接種、液體石蠟封存、 4 ℃冰箱保存。

1.2.2 內(nèi)生真菌的形態(tài)觀察與鑒定 從純化培養(yǎng)數(shù)日的菌落上挑取菌絲并連同分生孢子制成玻片，置于光學顯微鏡下觀察，對照資料[15]確定真菌的分類學地位。

1.2.3 內(nèi)生真菌的液態(tài)培養(yǎng) 1 000 mL三角瓶每瓶裝400 mL GYP培養(yǎng)基，1.25×105 Pa高壓滅菌30 min，冷卻至室溫備用。從試管斜面挑取菌絲到PDA培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)3～7 d，將活化后的菌絲接種到三角瓶中， 30 ℃搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)14 d。

1.2.4 內(nèi)生真菌粗提物的制備 液體培養(yǎng)完成后，取發(fā)酵產(chǎn)物用紗布過濾，得菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)液。菌絲體風干后用甲醇浸泡提取3次，每次24 h，合并甲醇提取液，50 ℃以下減壓回收甲醇，得到菌絲體甲醇提取物A；發(fā)酵培養(yǎng)液用乙酸乙酯等體積萃取3次，合并乙酸乙酯萃取液，50 ℃以下減壓回收乙酸乙酯，得到培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物B。

1.2.5 內(nèi)生真菌提取物體外抑菌活性測定 采用紙片瓊脂擴散法[16]測定內(nèi)生真菌YJ-11粗提物對金黃色葡萄球菌的抑制作用。將提取物A和提取物B分別溶于二甲基亞砜中，配成濃度為50 mg/mL的藥液備用。測定粗提物抑菌活性步驟如下：①制作金黃色葡萄球菌菌懸液。將金黃色葡萄球菌接種于LB液體培養(yǎng)基，室溫下靜置培養(yǎng)24 h，得菌懸液。②測定粗提物抑菌活性。在無菌條件下將金黃色葡萄球菌菌懸液均勻涂布于肉湯瓊脂培養(yǎng)基平板上，將直徑6 mm無菌藥敏紙片貼于平板上，其中2片藥敏紙片上分別加入100 μL含提取物A和B的二甲基亞砜藥液。試驗設陰性對照（僅加二甲基亞砜），陽性對照（加鏈霉素），3個重復。于35 ℃孵育24 h，測定抑菌圈直徑。

2 結果與分析

2.1 內(nèi)生真菌YJ-11的分離鑒定

通過分離培養(yǎng)得到一株純的內(nèi)生真菌YJ-11（圖1），其菌落呈淡藍色，氣生菌絲為松絮狀，分生孢子梗光滑，具橫隔，頂端生有掃帚狀分枝，初步鑒定為絲孢綱（Hyphomycetes）絲孢目（Hyphomycetales）青霉屬（Penicillium sp.）。

2.2 內(nèi)生真菌YJ-11體外抑菌活性

紙片瓊脂擴散法測定結果表明，藥敏紙片含5 mg提取物A和提取物B時，其周圍產(chǎn)生明顯的抑菌圈，抑菌圈直徑分別為（38.5±3.3） mm和（15.0±5.0） mm。根據(jù)紙片擴散法抑菌結果判斷標準[17]，確定內(nèi)生真菌YJ-11菌絲體和發(fā)酵培養(yǎng)液提取物對受試細菌金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌活性。該菌值得進一步研究開發(fā)。

3 結論

從廣東藥用植物五色梅葉中分離得到一株內(nèi)生真菌YJ-11，鑒定屬青霉屬，體外抑菌試驗結果表明，該內(nèi)生真菌菌絲體甲醇提取物和發(fā)酵培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物均能有效地抑制金黃色葡萄球菌。

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