小球藻適宜碳源及營養(yǎng)方式研究

摘要：篩選小球藻（Chlorella sp.）的適宜碳源，比較研究小球藻在不同營養(yǎng)方式下的生長情況。結(jié)果表明，葡萄糖能顯著促進小球藻生長，且小球藻可利用葡萄糖在化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)及兼養(yǎng)條件下均可生長，其比生長速率從大到小依次為：兼養(yǎng)、光異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、化能異養(yǎng)及光合自養(yǎng)。兼養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率接近于光合自養(yǎng)和光異養(yǎng)培養(yǎng)下的比生長速率之和。

關(guān)鍵詞：小球藻（Chlorella sp.）；微藻；適宜碳源；異養(yǎng)；兼養(yǎng)

中圖分類號：S968；Q949.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6030-04

隨著化石燃料的日益枯竭，現(xiàn)代社會依靠化石燃料的現(xiàn)狀遭到了嚴(yán)重的挑戰(zhàn)[1]。依照人類對化石燃料的消耗速率和現(xiàn)已探明的地球化石燃料儲量，化石燃料可能在未來50年消耗殆盡。因此，探尋可再生能源已迫在眉睫。生物柴油被認(rèn)為是最有望代替化石燃料的可再生能源[2，3]。由于傳統(tǒng)的植物油和動物脂肪的短缺，不能滿足生物柴油生產(chǎn)的原料供給[4]，微藻以其高生長速率、高油脂產(chǎn)率和生長空間廣闊等優(yōu)勢被認(rèn)為是最具潛力的生物柴油原料[5]。然而在微藻自養(yǎng)培養(yǎng)生產(chǎn)生物柴油的過程中也遇到了瓶頸問題。微藻在光合自養(yǎng)（Photoautotrophy）條件下生長速度緩慢，藻液濃度低，增加了微藻采收的成本[6]，使微藻制生物柴油用于商業(yè)生產(chǎn)的經(jīng)濟可行性很低[7]。解決這一問題的方法之一是在自養(yǎng)培養(yǎng)基中添加外加碳源，使微藻利用外加碳源進行異養(yǎng)（Heterotrophy）或兼養(yǎng)（Mixotrophy）生長。

與高等植物相比，微藻不僅可以利用光能和CO2進行光合自養(yǎng)生長，而且可以利用外加碳源進行異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長。光合自養(yǎng)的光抑制性是限制微藻生物量增加的主要原因，異養(yǎng)培養(yǎng)以外加碳為碳源和能源[8]，能夠降低光合自養(yǎng)培養(yǎng)的不足。Zheng等[9]通過異養(yǎng)培養(yǎng)Chlorella sorokiniana所得微藻細(xì)胞濃度是自養(yǎng)培養(yǎng)的3.3倍。異養(yǎng)培養(yǎng)和兼養(yǎng)培養(yǎng)不僅能提高微藻的生物量，還可以改變其油脂含量[10]，繆曉玲等[11]通過異養(yǎng)轉(zhuǎn)化細(xì)胞工程技術(shù)獲得了油脂含量高達(dá)57.9%的異養(yǎng)小球藻，使油脂含量在光合自養(yǎng)的基礎(chǔ)上提高了4倍。

小球藻（Chlorella sp.）為綠藻門小球藻屬普生性單細(xì)胞綠藻，是一種球形單細(xì)胞淡水微藻。目前，用于產(chǎn)油制生物柴油的小球藻主要有原始小球藻（Chlorella protothecoides）和普通小球藻（Chlorella vulgaris）等，關(guān)于小球藻培養(yǎng)的研究報道主要集中在自養(yǎng)培養(yǎng)和異養(yǎng)培養(yǎng)方面[12-14]，但對小球藻的自養(yǎng)、化能異養(yǎng)（Chemoheterotrophy）、光激活異養(yǎng) （Light-activated heterotrophic growth，LAHG）、光異養(yǎng)（Photoheterotrophy）和兼養(yǎng)培養(yǎng)的系統(tǒng)比較研究報道較少。本研究對小球藻適宜碳源和其營養(yǎng)方式進行了比較試驗，以期得到高密度培養(yǎng)小球藻的適宜培養(yǎng)方式，為微藻煉制生物質(zhì)燃料以及充分利用這一資源的其他領(lǐng)域提供相關(guān)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藻種

小球藻購自中國科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫。

1.2 培養(yǎng)基與試劑

SE基礎(chǔ)培養(yǎng)液（1 L）： NaNO3 250 mg， K2HPO4 75 mg， MgSO4·7H2O 75 mg， CaCl2·2H2O 25 mg， KH2PO4 175 mg， NaCl 25 mg， FeCl3·6H2O 5 mg， EDTA-Fe 1 mL， Trace mental solution 1 mL， 土壤提取液 40 mL， 蒸餾水958 mL。

試劑： 葡萄糖，丙酮酸鈉，乙酸鈉，碳酸氫鈉，碳酸鈉，3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU，購于Sigma公司），頭孢噻肟鈉。

1.3 培養(yǎng)條件

將配制分裝好的培養(yǎng)基在高壓滅菌鍋中121 ℃滅菌20 min，滅菌后冷卻至室溫，添加頭孢噻肟鈉至0.5 g/L防止染菌。在超凈臺中將生長至對數(shù)期的微藻接種于含150 mL培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中（接種量20% V/V）于溫度30 ℃、平均光照度5 000 lx的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，光暗比12 h∶12 h。

1.4 試驗設(shè)計

1.4.1 小球藻適宜碳源選擇 選取葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉作為小球藻的外加碳源，外加碳源濃度為0.1 g/L（按碳含量計，本試驗所添加的碳源濃度均以碳含量計。下同），每組設(shè)3個平行試驗，進行兼養(yǎng)培養(yǎng)。每隔24 h測定其生物量。

1.4.2 小球藻培養(yǎng)方式選擇 光合自養(yǎng)培養(yǎng)：將微藻接種于SE基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，在光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個平行試驗，每隔24 h測定其生物量。

兼養(yǎng)培養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，于光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個平行試驗，每隔24 h測定其生物量。

化能異養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，將錐形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個平行試驗，每隔24 h測定其生物量。

光激活異養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，將錐形瓶用黑色布袋包裹，于完全黑暗條件下培養(yǎng)，每24 h取下布袋，以5 000 lx脈沖式短波照射10 min。設(shè)置3個平行試驗，每隔24 h測定其生物量。

光異養(yǎng)：在SE培養(yǎng)基中添加碳濃度0.2 g/L的葡萄糖，并添加10-6 mol/L 3-（3，4-二氯苯基）-1，1-二甲脲（DCMU），于光照條件下培養(yǎng)。設(shè)置3個平行試驗，每隔24 h測定其生物量。

1.5 分析方法

式中μ為比生長速率（d-1），N1和N0分別為T1時刻和T0時刻時小球藻的細(xì)胞密度。

微藻干重測定：培養(yǎng)至10 d后，取100 mL藻液于8 000 r/min離心5 min，用蒸餾水洗2次，置于已恒重的稱量瓶中，105 ℃下烘干至恒重，用分析天平稱量，所得質(zhì)量減去稱量瓶質(zhì)量為小球藻細(xì)胞干重。

2 結(jié)果與討論

2.1 小球藻適宜碳源選擇

碳源是微藻異養(yǎng)、兼養(yǎng)生長最關(guān)鍵的影響因素，選擇合適的碳源對微藻異養(yǎng)、兼養(yǎng)生長的生物量產(chǎn)量和產(chǎn)物組成起到極為關(guān)鍵的作用。不同的微藻對碳源的需求不同，一些微藻既能利用有機碳又能利用無機碳進行兼養(yǎng)生長，同時進行呼吸過程和光合作用[16]。本研究以3種有機碳和2種無機碳為碳源，對小球藻生物量的影響見圖1，對小球藻比生長速率的影響見圖2。從圖1可以看出：小球藻均能利用葡萄糖、丙酮酸鈉、乙酸鈉、碳酸氫鈉和碳酸鈉進行生長，添加碳源的試驗組生長狀況均顯著優(yōu)于未添加碳源的對照組，其生物量分別是自養(yǎng)生長的3.1、2.7、1.6、2.0、1.5倍。從圖2可以看出：添加碳源的試驗組比生長速率分別是自養(yǎng)生長的2.5、2.4、1.6、2.0、1.7倍。其中，葡萄糖對小球藻生長的促進作用最為明顯，最終生物量和比生長速率分別是對照組的3.1和2.5倍。其原因可能與相同物質(zhì)量的碳源所含能量不同有關(guān)，如葡萄糖在代謝中能產(chǎn)生大約2.8 kJ/mol的熱量。

2.2 小球藻適宜培養(yǎng)方式

大量研究表明，許多微藻有利用外加碳源進行兼養(yǎng)和異養(yǎng)生長的能力。如魚腥藻（Anabeana）HB1017株能利用果糖、葡萄糖、蔗糖為底物進行化能異養(yǎng)生長[17，18]。集胞藻（Synechocystis sp.）PCC6803可以在每天短時光照（5 min）條件下利用葡萄糖進行光激活異養(yǎng)[19，20]，三角褐指藻（Pheaodactylum tricornutum Bohlin）具有兼養(yǎng)生長的能力[21]。

本試驗對小球藻自養(yǎng)、兼養(yǎng)和異養(yǎng)進行比較研究，結(jié)果如圖3和圖4所示。小球藻能利用葡萄糖進行化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長。在化能異養(yǎng)和光激活異養(yǎng)條件下，小球藻顏色依然為綠色，但生長緩慢。在添加DCMU的光異養(yǎng)條件下，小球藻生長狀況優(yōu)于化能異養(yǎng)和光激活異養(yǎng)，但培養(yǎng)12 d以后因葡萄糖耗盡而死亡。由于DCMU是光合作用抑制劑，在培養(yǎng)基中加入DCMU后，微藻細(xì)胞光系統(tǒng)Ⅱ的活性被抑制，阻斷了非環(huán)式電子傳遞，NADPH產(chǎn)生受阻，CO2不能被微藻同化吸收[22-24]。所以當(dāng)葡萄糖被耗盡時，如不再添加碳源，微藻細(xì)胞由于缺少生長所必需的碳源而死亡。在本試驗培養(yǎng)條件中，小球藻在兼養(yǎng)條件下的生長狀況最好，兼養(yǎng)培養(yǎng)兼有光合自養(yǎng)與異養(yǎng)代謝的性質(zhì)，大多數(shù)微藻兼養(yǎng)的比生長速率等于異養(yǎng)培養(yǎng)與自養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率之和（μ兼養(yǎng)=μ異養(yǎng)+μ自養(yǎng)）。在光合自養(yǎng)條件下，CO2作為惟一碳源維持微藻生長，而在光異養(yǎng)條件下，非環(huán)式電子傳遞被阻斷，CO2不能被同化吸收，微藻只能利用有機碳進行生長，由圖4可知，小球藻光合自養(yǎng)比生長速率（0.13）和光異養(yǎng)比生長速率（0.19）之和（0.32）非常接近于兼養(yǎng)比生長速率（0.33），基本可以認(rèn)定小球藻兼養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率等于光異養(yǎng)培養(yǎng)與自養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率之和（μ兼養(yǎng)=μ異養(yǎng)+μ自養(yǎng)）。培養(yǎng)10 d后，所得生物量產(chǎn)率如表1所示，小球藻化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長的生物量產(chǎn)率分別是自養(yǎng)生長的1.3、1.5、2.2、5.9倍。由此可知，兼養(yǎng)培養(yǎng)是獲得小球藻高密度、高產(chǎn)量、短周期培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)方式。

3 結(jié)論

小球藻能利用多種外加碳源進行異養(yǎng)兼養(yǎng)生長，在本試驗所選的3種有機碳和2種無機碳源中，葡萄糖促進其生長的效果最為明顯。

小球藻比生長速率從大到小依次為：兼養(yǎng)、光異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、化能異養(yǎng)及光合自養(yǎng)，其中兼養(yǎng)的比生長速率等于光合自養(yǎng)培養(yǎng)與光異養(yǎng)培養(yǎng)比生長速率之和。小球藻化能異養(yǎng)、光激活異養(yǎng)、光異養(yǎng)和兼養(yǎng)生長的生物量產(chǎn)率分別是自養(yǎng)生長的1.3、1.5、2.2、5.9倍。兼養(yǎng)培養(yǎng)是獲得小球藻高密度、高產(chǎn)量、短周期培養(yǎng)的最佳營養(yǎng)方式。

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