青海省胡盧巴根瘤菌的抗逆性

摘要：從青海省的西寧、大通和樂都各城區(qū)采集豆科植物胡盧巴（Trigonella foenum-grecum L.）的根瘤，經(jīng)分離、純化、鏡檢、回接獲得10株未知菌株，對獲得的根瘤菌進行耐鹽、耐酸堿、抗生素抗性和溫度敏感性等抗逆性測定。結(jié)果表明，供試菌株對酸堿的耐性比較強，所有菌株都能在pH 5～9的范圍內(nèi)生長；供試菌株耐鹽性較強，有4株菌株能在40 g/L NaCl上生長，其中1株菌株能在50 g/L NaCl上生長；對溫度的適應(yīng)范圍較寬；各菌株對不同種類、不同濃度抗生素的抗性存在差異。篩選出3株耐鹽、耐酸堿、生長溫度范圍廣和抗生素抗性較強的菌株，分別為QXT805、QXT808、QXT809。

關(guān)鍵詞：根瘤菌；抗逆性；胡盧巴（Trigonella foenum-grecum L.）；青海省

中圖分類號：Q939.11+4；S542 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）24-6020-03

根瘤菌是一類與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)關(guān)系甚為密切的革蘭氏陰性桿狀細菌。它們與豆科植物共生，通過侵染豆科植物根部或莖部形成根瘤和少數(shù)莖瘤，將空氣中的氮氣轉(zhuǎn)化為氨，進而轉(zhuǎn)化成植物可吸收利用的優(yōu)質(zhì)氮素——谷氨酸和谷氨酰胺類物質(zhì)[1]。由于青藏高原干燥、多風(fēng)、寒冷、缺氧等特殊生態(tài)環(huán)境的長期作用，使得該地區(qū)的植物較其他低海拔地區(qū)的植物在形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理生化等方面都有很大的差異，反映在豆科植物的根瘤菌上也有很大的差異性，尤其是抗逆性方面值得深入研究。胡盧巴（Trigonella foenum-grecum L.）是西部地區(qū)栽培利用時間較長的豆科植物，在青海省分布廣泛，資源豐富，其經(jīng)濟價值很高，具有廣闊的應(yīng)用前景[2]。近年來對胡盧巴的研究多為藥用和香料方面[3]，但對其根瘤菌抗逆性研究鮮見報道。本試驗研究了胡盧巴根瘤菌的耐鹽性、耐酸堿性、溫度敏感性和抗生素抗性，以期為青海省胡盧巴等栽培植物的根瘤菌資源保護和開發(fā)利用提供理論和實踐依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

從青海省西寧、大通、樂都的農(nóng)田采集栽培的初花期豆科植物胡盧巴根瘤，從采集的根瘤中獲得了93個分離物樣品，經(jīng)純化、鏡檢、初步鑒定和結(jié)瘤試驗篩選出10株待測菌株，這些菌株均來自西寧地區(qū)，具體見表1。

1.2 培養(yǎng)基

YMA液體培養(yǎng)基：蔗糖10.0 g，甘露醇10.0 g，酵母膏2.0 g， K2HPO4·3H2O 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，加蒸餾水定容至1 000 mL ，pH 7.0～7.4。

1.3 根瘤菌抗逆性試驗

1.3.1 耐酸堿性試驗[4] 以pH 7的YMA液體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，用HCl或NaOH調(diào)節(jié)培養(yǎng)基pH分別為5、6、7、8、9，以pH 7的YMA液體培養(yǎng)基為對照，20 ℃培養(yǎng)2～3 d。各處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.2 耐鹽性試驗[5] 將供試菌株分別接種于NaCl濃度分別為1、5、10、20、30、40、50 g/L的YMA液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，以不加NaCl的YMA液體培養(yǎng)基為對照，20 ℃培養(yǎng)2～3 d。各處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.3 溫度敏感性試驗[4] 將接種供試菌于4、20、41、50、65 ℃（其中41、50、65 ℃處理是將菌株分別在相應(yīng)溫度下水浴處理30 min后于20 ℃下繼續(xù)培養(yǎng)）的條件下培養(yǎng)2～3 d，以20 ℃為對照。各處理均設(shè)3次重復(fù)。

1.3.4 抗生素抗性試驗[6] 將供試菌株分別接種于含白霉素、林可霉素、頭孢匹林鈉、氨芐青霉素、阿米卡星的YMA液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，各抗生素終濃度分別設(shè)定為5、50、100、300 mg/L，以不接種抗生素的YMA液體培養(yǎng)基為對照，20 ℃培養(yǎng)2～3 d。各處理均設(shè)3次重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 胡盧巴根瘤菌的耐酸堿性

pH對根瘤菌生長的影響結(jié)果（表2）表明，供試菌株均能在pH 5～9的YMA液體培養(yǎng)基上生長，在pH 7時各菌株長勢好，在pH 5、pH 6和pH 9的培養(yǎng)液中除菌株QXT610長勢好外，其余菌株的長勢一般。菌株QXT807和QXT808在pH 6～9均有菌膜或菌環(huán)，菌株QXT809的培養(yǎng)液隨pH的增大顏色趨向綠色，顯示出與其他菌株的差異性。

2.2 胡盧巴根瘤菌的耐鹽性

耐鹽性測定結(jié)果（表3）表明，供試菌株表現(xiàn)出不同程度的耐鹽性。所有菌株均能在含1 g/L和5 g/L NaCl的YMA液體培養(yǎng)基上生長；菌株QXT607、QXT609和QXT611的耐鹽性較差，在含10 g/L NaCl的YMA液體培養(yǎng)基上已不能生長；菌株QXT805、QXT807、QXT808、QXT809、QXT810和QXT603均能在含30 g/L NaCl的YMA液體培養(yǎng)基上生長；菌株QXT805、QXT807、QXT808、QXT809均能在含40 g/L NaCl的YMA液體培養(yǎng)基上生長；菌株QXT809還能在含50 g/L NaCl的YMA液體培養(yǎng)基上生長，表現(xiàn)出了很強的耐鹽性。表明分離自同一地區(qū)不同生長時期的胡盧巴根瘤菌在耐鹽性方面也存在一定的差異性。

2.3 胡盧巴根瘤菌的生長溫度范圍

溫度對根瘤菌生長的影響的測定結(jié)果見表4。由表4可知，供試菌株均能在20 ℃和41 ℃的條件下生長；菌株QXT805、QXT807、QXT808、QXT809、QXT810均能在50 ℃下生長；菌株QXT805還能在65 ℃和4 ℃下生長，表現(xiàn)出較強的耐高溫和低溫的特性，對溫度的適應(yīng)范圍寬；菌株QXT808和QXT809能在4 ℃的低溫條件下生長，表現(xiàn)出耐低溫的特性，這與其生長的環(huán)境因素有一定的關(guān)系。

2.4 胡盧巴根瘤菌的抗生素抗性

供試菌株對5種抗生素的天然抗藥性測定結(jié)果見表5。由表5可知，所有供試菌均對白霉素（5、50、100 mg/L）、林可霉素（5、50 mg/L）、頭孢匹林鈉（5、50、100 mg/L）， 氨芐青霉素（5、50 mg/L）表現(xiàn)出抗性，對阿米卡星（5、50、100、300 mg/L）敏感。70%的菌株對100 mg/L林可霉素表現(xiàn)出抗性，50%的菌株對300 mg/L林可霉素表現(xiàn)出抗性， 60%的菌株對300 mg/L頭孢匹林鈉、100 mg/L氨芐青霉素表現(xiàn)出抗性。菌株QXT807和QXT809對300 mg/L白霉素表現(xiàn)出抗性，菌株QXT809對300 mg/L氨芐青霉素仍表現(xiàn)出抗性。說明各菌株對不同種類、不同濃度抗生素的抗性存在差異。

3 結(jié)論

通過對青海省胡盧巴根瘤菌的抗逆性測定，結(jié)果顯示，菌株QXT809能夠在50 g/L NaCl的YMA液體培養(yǎng)基上生長，表現(xiàn)出了很強的耐鹽性。所有供試菌株在pH 7條件下長勢較好，菌株QXT809的培養(yǎng)液隨pH的增大顏色趨向綠色，顯示出與其他菌株的差異性。有5株菌株均能在50 ℃條件下生長，菌株QXT805既能在65 ℃下生長，又能在4 ℃下生長，表現(xiàn)出較強的耐高溫和低溫的特性，對溫度適應(yīng)范圍廣； 菌株QXT808和QXT809能在4 ℃的低溫條件下生存，表現(xiàn)出耐低溫的特性。供試菌株對抗生素抗性的測定結(jié)果表明，各菌株間對不同種類、不同濃度抗生素的抗性存在差異，即使是來自同一地區(qū)同一生長時期的菌株間也有差異。篩選出了3株耐鹽、耐酸堿、生長溫度范圍廣和抗生素抗性較強的菌株，分別為QXT805、 QXT808、 QXT809。這可能與其長期生長在青藏高原干燥、多風(fēng)、寒冷、缺氧等的特殊生態(tài)環(huán)境中有一定的關(guān)系。研究結(jié)果表明，分離自不同地區(qū)、不同生長時期宿主的胡盧巴根瘤菌是一個復(fù)雜的群體，抗逆性方面表現(xiàn)出了豐富的多樣性。

參考文獻：

[1] FAO. Technical Handbook on Symbiotic Nitrogen Fixation Legume/Rhizobium[M].Rome， Italy： FAO，1983.

[2] 張 慧，劉 力，曾玲力，等.GC-MS法測定胡蘆巴籽中脂肪酸成分的含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2003（3）：284.

[3] 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志（第三冊）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，1961.

[4] 陳今朝，張 紅，顧素芳，等.培養(yǎng)條件對篩選根瘤菌突變體的影響[J].中國微生態(tài)學(xué)雜志，1999，1（6）：346-348.

[5] 吳 建，楊蘇聲，李季倫.苜蓿根瘤菌（Rhizobium meliloti）的耐鹽性研究[J].微生物學(xué)報，1993，33（4）：260-267.

[6] 刁治民，馮廷花.蠶豆根瘤菌抗藥性菌株的篩選[J].青海畜牧獸醫(yī)雜志，1994，24（6）：22-24.