大蒜提取物對結核分枝桿菌基因表達變化的影響

鐘英英a，葉 云a，李乃雄b，譚江志a

（廣西工學院，a.生物與化學工程學院；b.理學院，廣西 柳州 545006）

摘要：通過歸一化對芯片數據進行質量控制，采用兩樣本非配對t檢驗，比較了2、5和10 μg/mL的大蒜（Allium sativum L.）提取物處理結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）后對其基因表達變化的影響。結果表明，5和10 μg/mL的大蒜提取物處理后獲得共同差異基因17個，與氧化應激、蛋白損傷等生物學功能相關。大蒜提取物可能通過上述基因的調控起到抑制結核分枝桿菌的作用。

關鍵詞：大蒜（Allium sativum L.）提取物；結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis）；基因芯片；氧化應激

中圖分類號：S633.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5054-03

Effect of Garlic Extract on Gene Expression in Mycobacterium tuberculosis

ZHONG Ying-yinga，YE Yuna，LI Nai-xiongb，TAN Jiang-zhia

（a.School of Biological and Chemical Engineering；b.College of Science， Guangxi University of Technology， Liuzhou 545006， Guangxi，China）

Abstract： To investigate the effect of garlic（Allium sativum L.） extract on changes of gene expression in Mycobacterium tuberculosis， gene profile was analyzed. Quality of microarray data was controlled by normalization. The difference between treated with garlic extract and control in Mycobacterium tuberculosis was compared by two sample non-paired t-test. The results showed that 17 differential genes were overlapped in the treatment with 5 and 10 μg/mL garlic extract. These genes are related with oxidative stress and protein damage. Therefore， garlic extract may inhibit the Mycobacterium tuberculosis by regulating the expression of these differential genes.

Key words： garlic（Allium sativum L.）extract； Mycobacterium tuberculosis； gene chips； oxidative stress

結核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），俗稱結核桿菌，是引起結核病的病原菌。盡管國際上針對結核分枝桿菌已開發(fā)出近20種藥物，但其副作用大，尤其對肝腎的毒副作用較大，易產生耐藥性。近年來耐藥及多重耐藥菌株（Multiple drugs resistant-bacilus tuberculosis，MDR-TB）的出現，更是對現有的抗結核藥物提出了嚴重挑戰(zhàn)。因此，從天然藥物中尋找安全有效的抗結核藥物，具有重要的意義[1，2]。

大蒜（Allium sativum L.）提取物具有廣譜的抗菌活性，對常見的細菌均有較好的抗菌作用。研究表明大蒜素對結核分枝桿菌具有很強的殺菌和抑菌作用[3，4]，而且大蒜素為常用的調味劑，無明顯的毒副作用。因此對那些肝功能異常，多種抗結核藥物不能使用及耐藥性的結核病人，大蒜素不失為一個較好的選擇[5]。然而目前大蒜素作用于結核分枝桿菌的研究大多還停留在抑菌效果的觀察方面，對其抑菌的分子機理仍然不夠清楚，結合基因芯片技術對大蒜提取物處理結核分枝桿菌的基因組進行分析，探討其作用的分子機制，有利于從天然產物資源中尋找并開發(fā)有效的抗結核藥物。本研究通過歸一化對芯片數據進行質量控制，采用兩樣本非配對t檢驗，比較了2、5和10 μg/mL的大蒜提取物處理后對結核分枝桿菌的基因表達變化。

1 材料與方法

1.1 芯片數據

基因芯片數據GSE17640來源于GEO（Gene expression omnibus）（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo）公共數據庫，是4個雙通道芯片樣本[6]，芯片平臺為非商業(yè)化的GPL9036（SMD Print_1651 Mycobacterium tuberculosis）。

1.2 芯片制作

結核分枝桿菌H37Rv （ATCC 27294）在37 ℃下用米德爾7H9培養(yǎng)基（包含0.2%甘油、0.5%BSA fraction V、0.05%吐溫-80、0.08%NaCl和0.2%葡萄糖）培養(yǎng)至OD650 nm等于0.3（2～3 h）時，用2、5和10 μg/mL的大蒜提取物處理6 h后提取RNA，對照組則用等量的二甲基亞砜處理6 h后提取RNA，經反轉錄后分別合成標記cDNA制作芯片。

1.3 數據預處理及統計學分析

從GEO數據庫中下載芯片數據的原始文件GSM440246、GSM440247、GSM440248、GSM440249分別解壓縮之后，去除每組數據表頭的注釋信息，僅留有基因名稱（Gene ID）和表達值（MEAN），即CH1I_MEAN，CH2I_MEAN，并將其分別對應于對照和處理，制成一個樣本表達值的文本文檔。

使用統計學軟件進行芯片數據統計學處理。首先采用justvsn方法進行歸一化處理，通過生成箱式圖檢驗歸一化效果。然后，將表達值數據進行以2為底的對數轉換，用SAM（Significance analysis of microarrays）方法進行兩樣本非配對t檢驗，用以篩選經大蒜提取物處理組和對照組的結核分枝桿菌差異基因，排列組合（permutation）次數設為1 000次，P值設定為0.05，假陽性發(fā)現率（FDR）小于0.01。通過NCBI數據庫對獲得的差異基因進行注釋，同時對差異基因本體（Gene ontology，GO）實施分析，以找到這些基因對應的生物學功能。

2 結果與分析

2.1 數據處理的質量控制

芯片數據歸一化結果的箱式圖如圖1所示?？v軸是數據值，橫軸是芯片數據集中的樣本名稱，共8個樣本。每一個樣本用一個方框表示，框中間的橫線表示數據的中位值。經過歸一化后樣本數據的中位值基本相等，有效地消除或降低了樣本和芯片造成的系統偏差，從而有利于發(fā)現更有意義的生物學信息。

2.2 差異基因的獲得

將結核分枝桿菌芯片樣本分為兩組：對照組和大蒜提取物處理組。5、10 μg/mL大蒜提取物處理組獲得倍數變化為2倍以上的基因分別為56個和101個，將這些差異基因進行交集共獲得17個共同的差異表達基因，有部分為功能未知基因，功能已知的有trxB2、trxC、clpB、sigH、dnaJ、dnaK、Hsp、Rv0331、Rv3463、Rv3054c、Rv1334和Rv1335等，這12個基因經大蒜提取物處理后在結核分枝桿菌中表達上調，而deoD、sigB、ptpA、Rv2111c和esxA等5個基因則表達下調。

2.3 差異基因的功能注釋

通過NCBI數據庫對上述差異表達基因進行注釋，發(fā)現上調基因主要與熱激反應、氧化應激、蛋白損傷等生物學功能相關。其中，trxB2、trxC與硫氧還蛋白系統的組分有關，即受蛋白質損傷的影響較大；而Rv0331、Rv3463、Rv3054c、Rv1334、Rv1335、clpB、 sigH、dnaJ、dnaK和hsp與熱激反應有關。下調基因中Rv2111c和esxA功能未知，deoD、sigB則與DNA復制、轉錄有關。

差異基因的GO分析表明，上調基因主要參與了生物過程中的化學刺激的細胞反應、細胞氧化應激反應和活性氧物種反應等。如clpB、Rv346、dnaK和Hsp是細胞中膜和質膜等結構的主要組分，dnaK和Hsp應對在生物過程中各類應激反應。

3 小結與討論

由于基因芯片技術只是一種半定量的分析手段，存在一定的誤差。因此，基因芯片數據的準確性直接影響到后期的分析，因此如何獲得高質量的基因芯片數據是關鍵環(huán)節(jié)[7]?；谏鲜鲈?，在數據處理的前期先經過芯片數據歸一化等質量控制的手段，盡可能消除由于數據偏差帶來的試驗誤差，獲得更為準確的分析結果。

大蒜是一種藥食兩用的食品，大蒜提取物的主要成分為大蒜素。體外抑菌試驗結果表明，高濃度大蒜素對結核分枝桿菌具有很強的殺菌和抑菌作用，機制可能是大蒜素分子中的氧原子與細菌生長繁殖所必須的半胱氨酸分子中的巰基結合，能抑制結核分枝桿菌蛋白質的合成，同時抑制細菌旋轉酶而使DNA復制受阻、降解而致結核分枝桿菌死亡[8]。本研究通過基因芯片的表達譜分析，發(fā)現低濃度的大蒜提取物處理對結核分枝桿菌也有影響，會導致部分熱激反應、氧化應激反應以及蛋白損傷相關的基因表達上調，而一些與轉錄及翻譯相關的基因則表達下調，表明DNA復制和蛋白質合成等生物學活動受到了一定的抑制。

氧化應激是由自由基在體內產生的一種負面作用，被認為是導致衰老和疾病的一個重要因素。氧化應激起源于反應性的氧化物與生物抗氧化劑間平衡的破壞，造成活性氧濃度升高，過多的自由基會引起毒性作用。因此，氧化應激相關基因表達上調可能導致結核分枝桿菌生物膜脂質過氧化，細胞內蛋白及酶變性，核酸和染色體被破壞，導致細胞死亡[9]。有研究表明，在細菌衰老過程中，轉錄錯誤或翻譯錯誤會導致部分異常多肽的輕微錯誤折疊，導致蛋白質疏水表面的增加，從而使得DnaK/DnaJ的伴侶蛋白系統的作用位點增加，進一步增加蛋白質氧化作用的敏感性和蛋白質錯誤折疊[10]。在分析基因芯片數據的過程中，也發(fā)現trxB2、trxC、dnaJ和dnaK等與蛋白損傷相關基因表達上調，其中dnaJ和dnaK表達上調這可能是由于結核分枝桿菌經過大蒜提取物處理后受到自由基的攻擊，導致蛋白損傷，從而降低或失去原有蛋白質的功能，加速細胞衰老。另外，經過大蒜油的處理也會使得結核分枝桿菌的Rv0331，Rv3463，Rv3054c，Rv1334和Rv1335等基因表達上調，誘導結核分枝桿菌產生熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）并在其體內迅速積累，導致相關蛋白折疊、正常的蛋白合成受到抑制、細胞內分配及降解；還會對胞內酶造成破壞，細胞正常的代謝受阻，導致生長發(fā)育終止或者引起細胞死亡[11]。

參考文獻：

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