紫外—可見光分光光度法測定攀莖耳草中總生物堿

摘要：采用堿浸、超聲輔助氯仿萃取法提取攀莖耳草（Hedyotis scandens Roxb.）干燥根皮中的總生物堿，并以小檗堿為對照品，采用紫外分光光度法測定其相對含量。結(jié)果表明，小檗堿對照品在0～53.33 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系（R2=0.999 4，RSD=0.253%）。該方法操作簡便、結(jié)果可靠，為攀莖耳草開發(fā)提供了一定的科學(xué)參考。

關(guān)鍵詞：攀莖耳草（Hedyotis scandens Roxb.）；總生物堿；紫外分光光度法

中圖分類號：R284.2 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-5028-03

Determination of Total Alkaloid in Hedyotis scandens Roxb. by UV-Vis Spectrophotometry

HE Ke-quna，LI Xiang-xingb，YANG Qionga，LU Wen-Yuna

（a.Chemistry and Environmental Science Department；b. Ethnology and Sociology Department， Guizhou Minzu University，Guiyang 550025，China）

Abstract： The content of total alkaloid in Hedyotis scandens Roxb. was determined by ultraviolet visible spectrophotometry （UV-Vis） based on the standard curve with berberine as the control. The results showed that there was a good linearity （R2=0.999 4， RSD=0.253%） in the range of 0～53.33 μg/mL. It was a simple and reliable method for measuring the content of total alkaloid in Hedyotis scandens Roxb.. It provides a scientific reference for exploiting Hedyotis scandens Roxb..

Key words： Hedyotis scandens Roxb.； total alkaloid； UV-Vis spectrophotometry

攀莖耳草（Hedyotis scandens Roxb.）是茜草科（Rubiaceae）耳草屬植物，又名攀援耳草、涼喉茶、理肺散、接骨丹、小接骨。多年生攀莖狀草質(zhì)藤本，長可達5～10 m。主根發(fā)達，圓柱形，多彎曲。莖圓柱形，有槽及細條紋，具分枝，無毛，具明顯托葉鞘。葉對生；近無柄或具長2～3 mm葉柄；葉片紙質(zhì)，長橢圓形或橢圓狀披針形，先端漸尖，基部楔形，上面綠色，下面綠白色，兩面平滑無毛，側(cè)脈3～4對。全緣。聚傘花序頂生，密集；總花梗被柔毛；苞片線形，長2～3 mm，被毛，花梗長3～4 mm；花萼漏斗狀，長2 mm，先端具4淺齒，齒間有2～3枚腺體外凸；花冠白色，花冠筒長2 mm，裂片4，長約4 mm，反曲，基部密生曲長柔毛；4個雄蕊，花藥外露，柱頭2裂，密生短柔毛。蒴果球形，直徑約5 mm，黑色，開花期在8月[1，2]。攀莖耳草僅分布于在我國云南和國外的喜馬拉雅山脈和緬甸等地[3]。攀莖耳草全株均可入藥，具有清熱解毒，潤肺止咳，續(xù)筋接骨功效，主治肺炎、支氣管炎、口腔炎、肺結(jié)核、骨折等，是我國云南白族、哈尼族、傣族的常用中草藥[1，2，4]?，F(xiàn)有研究表明，耳草屬植物中的主要功效成分為五環(huán)三萜及其苷類、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、蒽醌類、生物堿類等，具有調(diào)節(jié)免疫、抗誘變、抗腫瘤、抗菌消炎、調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)系統(tǒng)等功效[5]。但目前國內(nèi)外相關(guān)研究較少，僅有齊墩果酸、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖苷、槲皮素、芹菜素等三萜類及黃酮類化學(xué)成分報道[6]，而攀莖耳草生物堿類化學(xué)成分還未見報道。本試驗初步分析了攀莖耳草根皮水提物化學(xué)成分，并采用紫外分光光度法分析了總生物堿的含量。

1 材料與方法

1.1 材料

攀莖耳草購自云南省云龍縣，保存于貴州民族大學(xué)化學(xué)與環(huán)境科學(xué)學(xué)院藥學(xué)教研室。

1.2 試劑與儀器

小檗堿對照品（≥98%），購自貴州迪大科技有限責(zé)任公司。

硝酸鉍、冰醋酸、鹽酸、碘、碘化鉀、碳酸鈉、濃氨水、無水乙醇、氯仿等均為分析純，大孔樹脂D101，購于青島海洋有限公司。

756PC紫外-可見分光光度計（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；SG3200HE超聲清洗儀（上海冠特超聲儀器有限公司）；METTLERAE240電子分析天平（上海天平儀器廠）；BGZ-30電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州博遠實驗分析儀器有限公司）；SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 方法

1.3.1 攀莖耳草總生物堿試液的提取 將粉碎的植物樣品約2 g，加去離子水20～30 mL，并滴加數(shù)滴鹽酸后，于60 ℃水浴15 min，過濾，濾液供生物堿預(yù)試試驗[7]。在預(yù)試驗基礎(chǔ)上，以10%（V/V，下同）氨水浸潤、超聲輔助氯仿萃取法提取攀莖耳草總生物堿[8，9]：精確稱取干燥、研碎攀莖耳草根皮5.000 g于150 mL具塞錐形瓶中，加入適量10%氨水浸潤1 h，加30 mL氯仿?lián)u勻，蓋上磨口玻璃塞，放置24 h后，超聲提?。?0 kHz，150 W），共提取3次，每次15 min，每次用30 mL氯仿，提取結(jié)束后合并提取液，用3%（V/V）鹽酸水溶液萃取3次，每次30 mL，合并酸水萃取液，用體積比1∶1的氨水調(diào)pH至10左右，再用氯仿萃取3次，每次30 mL，合并萃取液并回收氯仿，以適量50%乙醇溶解，備用。

1.3.2 大孔樹脂D101純化攀莖耳草的總生物堿 大孔樹脂D101按照文獻[10，11]進行預(yù)處理，將“1.3.1”所得攀莖耳草總生物堿提取液上柱，流速為1 mL/min，先用水洗5倍柱體積，再用10%（V/V，下同）乙醇溶液洗脫5倍柱體積，流速調(diào)為0.8 mL/min，收集10%乙醇洗脫液，用50%乙醇定容至100 mL，備用。

1.3.3 小檗堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液的制備 精確稱取小檗堿20.00 mg于50 mL容量瓶中，加50%乙醇適量，充分溶解后，定容，配制濃度為0.400 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。

1.3.4 UV-Vis光譜的測定 分別取適量濃度的小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液及經(jīng)大孔樹脂D101純化后的攀莖耳草總生物堿提取液適量，以50%乙醇為空白建立基線，在200～500 nm掃描，得小檗堿對照品及攀莖耳草紫外吸收光譜。

1.3.5 線性關(guān)系的考察 精確吸取小檗堿標(biāo)準(zhǔn)儲備液0，1.00，3.00，5.00，7.00，10.00 mL分別置于6支100 mL比色管中，準(zhǔn)確加入50%乙醇定容至75.00 mL，搖勻，得到濃度分別為0、5.33、16.00、26.67、37.33、53.33 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)操作液。以50%乙醇為空白，測定OD270 nm，以O(shè)D270 nm為縱坐標(biāo)，小檗堿濃度（μg/mL） 為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.6 重復(fù)性考察 精確稱取攀莖耳草根皮樣品5份，按上述方法測定，計算RSD。

1.3.7 攀莖耳草總生物堿的測定 取樹脂純化提取液適量，以50%乙醇為空白，在270 nm下測定攀莖耳草的OD270 nm，代入回歸方程，計算攀莖耳草的總生物堿含量（mg/g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中生物堿成分預(yù)試驗

從表1可看出，攀莖耳草根皮乙醇提取液有明顯的生物堿反應(yīng)。

2.2 小檗堿、攀莖耳草的紫外吸收光譜

圖1、圖2表明，小檗堿標(biāo)準(zhǔn)溶液和攀莖耳草樣品溶液的紫外吸收光譜在270 nm處均有較大吸收。

2.3 方法學(xué)考察

小檗堿的線性回歸曲線見圖3，其回歸方程為Y=0.051 6X+0.114 1，R2=0.999 4，結(jié)果表明，在0～53.33 μg/mL范圍，小檗堿濃度與吸光度的線性關(guān)系良好。

2.4 樣品中總生物堿含量測定

樣品中總生物堿含量的測定結(jié)果如表2所示。從表2可知，5份樣品平均總生物堿含量為0.952 5 mg/g，RSD為0.253%，表明重復(fù)性良好。

3 小結(jié)

本試驗研究了攀莖耳草根皮的紫外光譜及總生物堿含量。結(jié)果表明，攀莖耳草干燥根皮中總生物堿含量豐富，達到0.952 5 mg/g。該結(jié)果為民族藥攀莖耳草的藥用價值開發(fā)及化學(xué)成分的深入研究提供了參考。

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