中藥及復方水提物對DPPH·和·OH的清除作用

中藥及復方水提物對DPPH·和·OH的清除作用

龔永歡，劉 霞，周海霞，李 偉，馬 林

（西南科技大學生命科學與工程學院，四川 綿陽 621000）

摘要：采用分光光度法分析測定了具有抗仔豬腹瀉作用的12種中藥及5個復方的水提物對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的清除能力，并對其多糖含量進行了測定。結果表明，12種中藥及5個復方對DPPH·和·OH均有一定程度的清除作用。濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內，秦皮、白頭翁、黃連、黃柏以及復方2、4、5對DPPH·清除作用較好，在高濃度時與維生素C對DPPH·的清除作用相當。除復方3外，中藥復方在高濃度時對DPPH·的清除率接近或高于其組成中藥，表現(xiàn)出協(xié)同效應。濃度在5～25 mg/mL范圍內，白術、防風、魚腥草及復方1和復方3對·OH的清除作用較好，復方1和復方3表現(xiàn)出對·OH清除的協(xié)同作用。中藥及其復方多糖含量與DPPH·和·OH清除作用不存在明顯的相關性。

關鍵詞： 抗腹瀉中藥；抗氧化；1，1-二苯基-2-苦基肼自由基；羥基自由基

中圖分類號：R932 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-4995-05

Scavenging Effect of Aqueous Extracts from Some Anti-diarrhea Chinese Herbs and Compounds on DPPH· and ·OH

GONG Yong-huan，LIU Xia，ZHOU Hai-xia，LI Wei，MA Lin

（School of Life Science and Engineering， Southwest University of Science and Technology， Mianyang 621000， Sichuan， China）

Abstract： Using spectrophotometric and phenol-sulfuric acid method， the scavenging effect on DPPH and hydroxyl radicals， and the polysaccharide contents in the aqueous extracts from 12 Chinese herbs and 5 compounds with anti-diarrhea effects were investigated. The results showed that all 12 Chinese herbs and 5 compounds had scavenging effect on DPPH· and ·OH with different degree. With the concentration of 0.2 to 1.0 mg/mL， the Cortex fraxini， Radix pulsatillae， Rhizoma coptidis and Cortex phellodendri and the compounds 2， 4 and 5 had high scavenging effects on DPPH·. The scavenging effect was close to that of vitamin C at 0.8 mg/mL and 1.0 mg/mL. Except the compounds 3， other compounds had synergistic effect and showed higher scavenging effect on DPPH than that of its component herbs with tested concentration. Under the concentration of 5 mg/mL to 25 mg/mL， the extracts from Rhizoma atractylodis， Radix saposhnikoviae and Houttuynia cordata and compounds 1 and 3 had good scavenging effect on hydroxyl radicals. Similarly， the compounds 1 and 3 showed synergistic effect. There was no significant correlation between the polysaccharide content of different herbs， compounds and the scavenging effect on DPPH· and ·OH.

Key words： anti-diarrhea Chinese herbs； antioxidant； DPPH·； ·OH

早期斷奶仔豬因消化器官發(fā)育不充分、消化酶分泌不足、免疫力低下等極易帶來嚴重的應激反應，導致腸道系統(tǒng)紊亂及腹瀉[1]。正常情況下，機體內自由基的產生與清除處于動態(tài)平衡，維持著機體的正常生理機能，但當仔豬在遭受患病、應激或者日糧中營養(yǎng)缺乏等情況下，機體代謝出現(xiàn)異常，自由基將過量產生。自由基活性極高，攻擊性很強，導致機體發(fā)生一系列變化，致使動物病理狀況加重[2，3]。中國全年仔豬平均腹瀉發(fā)病率為46.5%[4]，因腹瀉死亡的仔豬占仔豬總數(shù)的39.8%[5]，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經濟損失。生產上多采用向日糧中添加一定量的抗生素來預防仔豬腹瀉，應用抗生素雖帶來了良好的經濟效益，但長期、高劑量的使用會導致病原菌產生耐藥性以及抗生素殘留，這些問題已引起了廣泛爭議，限制使用或禁止使用抗生素添加劑已在歐盟、日韓等國開始實施，尋找新的抗生素替代品已成為必然[6，7]。研究表明，無機元素、益生菌、益生素、有機酸、酶制劑、低聚糖、動物血粉及中草藥制劑或這些抗生素替代品的聯(lián)合應用，具有改善仔豬生長性能、防治腹瀉、提高免疫等效應，其中，中草藥以其具有的抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化及免疫調節(jié)等功能，以及細菌不易產生耐藥性、容易降解、無殘留等優(yōu)點更加受到重視[8-10]。

目前，關于仔豬抗腹瀉中藥的抗氧化研究大多為體外測定血液生化指標，如血液中丙二醛含量、一些酶的活性或含量，而直接研究體外對自由基的清除影響則少有報道。馬玉芳等[11]向基礎日糧中按4 kg/t的量添加中藥飼料添加劑，發(fā)現(xiàn)血清中超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過氧化物酶和過氧化氫酶的活性均較抗生素對照組高，而丙二醛的含量均比抗生素對照組低；張世昌[12]的研究結果表明，兩個中藥復方處理其谷胱甘肽過氧化物酶含量較對照組分別提高了26.14%和30.49%，處理組超氧化物歧化酶的含量也有所提高，而丙二醛的含量則明顯降低。中草藥及其制劑在生物機體內清除自由基的作用機制雖復雜多變，但針對特定的自由基進行體外研究條件易控、操作簡便，有助于進一步闡釋中草藥的抗氧化機制。本研究測定了具有抗腹瀉作用的12種中藥及5個復方的水提物對1，1-二苯基-2-苦基肼自由基（DPPH·）和羥基自由基（·OH）的體外清除作用，并分析了多糖含量與自由基清除作用的相關性。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器與設備 分光光度計（尤尼柯儀器有限公司），旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），高速離心機（太倉市科教器材廠），精密電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.1.2 試劑 DPPH（分析純，日本東京化成株式會社生產），抗壞血酸、水楊酸、雙氧水、硫酸亞鐵、葡萄糖和苯酚等均為分析純。

1.1.3 中藥材 黃連、刺五加、魚腥草、黃柏、陳皮、龍膽草、黃芪、甘草、白頭翁、白術、防風、秦皮等12種中草藥材均購自四川本草堂藥業(yè)有限公司，由綿陽師范學院羅明華教授鑒定為正品。

1.2 試驗方法

1.2.1 中藥水提物制備 供試材料為上述12種藥材及按適當比例組配的5個復方（復方1：刺五加、黃芪、魚腥草及甘草；復方2：白頭翁、黃柏、陳皮及黃連；復方3：黃芪、白術及防風；復方4：白頭翁、龍膽草及黃連；復方5：白頭翁、黃柏、黃連及秦皮）。12種中藥及5個復方分別粉碎過60目篩，55 ℃烘至恒重。分別取100 g中藥粉末，按料液比1∶15（g/mL）加入蒸餾水，加熱提取2 h（急火加熱至沸，然后文火煎煮），離心。離心后的藥渣再按同樣方法提取2次。合并3次提取的離心上清液，濃縮至90 mL左右，定容為1 g生藥/mL，置4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 中藥對DPPH·的清除作用 參照許申鴻等[13]的方法，略加改動。取0.1 mmol/L的DPPH溶液2～10 mL于試管中，再分別加入濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL 的各中藥水提物2 mL，振蕩混勻，室溫避光反應 30 min， 于517 nm處測定吸光度值。以維生素 C為對照，按同樣方法測定。

1.2.3 復方對·OH的清除作用 參照張強等[14]的方法作適當修改。取10 mL試管，依次加入9 mmol/L的FeSO4溶液及9 mmol/L水楊酸溶液各1mL，再分別加入預先稀釋好的濃度為5、10、15、20和25 mg/mL中藥水提物，最后加入8.8 mmol/L H2O2溶液1 mL啟動反應。置37 ℃水浴反應30 min，在510 nm波長測定吸光度值，以維生素C為對照。

1.2.4 中藥水提物多糖含量測定 取濃度為1 g生藥/mL的12種中藥及復方的水提物各25 mL，加4倍體積95%的乙醇浸提6～8 h。真空抽濾，醇沉物用無水乙醇、丙酮和乙醚依次洗滌，得粗多糖，干燥至恒重。

配制葡萄糖標準液，采用苯酚-硫酸法[15]測定濃度為0、0.01、0.02、0.03、0.04和0.05 mg/mL的葡萄糖溶液在490 nm波長的吸光度值。

取制備的中藥粗多糖適量，用蒸餾水溶解配制成0.1～1.0 mg/mL濃度，按測定葡萄糖標準液方法操作，每個樣品重復測定3次，取其平均值。

2 結果與分析

2.1 12種中藥對DPPH·的清除作用

根據(jù)12種中藥對DPPH·的清除率的相對高低，劃分為高清除率組、中等清除率組和低清除率組，結果見圖1。12種中藥在濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內，隨著濃度增加，對DPPH·的清除能力均增強。在濃度為1.0 mg/mL時，秦皮、白頭翁、黃連清除作用較好，與維生素C的清除能力相接近，而白術和黃芪的清除效果相對較差，清除率不足40%，黃柏、刺五加、魚腥草、龍膽草、甘草、陳皮及防風清除率在51%～84%。在濃度為0.2 mg/mL時，僅有秦皮具有較高的DPPH·清除能力（78%），其余中藥清除率范圍為10%～53%。

2.2 中藥復方對DPPH·的清除作用

由圖2可知，中藥復方濃度在0.2～1.0 mg/mL范圍內，隨著濃度增加對DPPH·的清除作用增強，復方1、2、4和5清除作用明顯優(yōu)于復方3，其中復方5在各濃度時清除率都高于其他復方組。在濃度為1.0 mg/mL時，復方1、2、4和5的清除能力與維生素C的清除能力相接近，復方3的清除率僅為19.6%；在濃度為0.2 mg/mL時，復方3對DPPH·幾乎沒有清除作用，其余復方清除率范圍為15%～43%。復方2、4及5清除率高可能與其中均含有白頭翁和黃連有關。將各復方與其組成成分進行比較，除復方3外，其余中藥復方在0.8 mg/mL和1.0 mg/mL時對DPPH·的清除作用接近或高于單一中藥，表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化效應。

2.3 12種中藥對·OH的清除作用

由圖3可知，清除率相對較高的中藥包括白術、刺五加、防風和魚腥草，清除率中等的中藥有白頭翁、黃芪、黃連和陳皮，清除率低的為龍膽草、甘草、秦皮和黃柏。中藥濃度在5～25 mg/mL范圍內，隨著濃度增加其對·OH的清除作用增強，其中白術、刺五加、防風及魚腥草清除作用相對較高，秦皮和黃柏作用效果相對較差，隨著濃度增加，對·OH清除作用增長幅度很小。在25 mg/mL時白術、刺五加、防風及魚腥草清除率均高于60%，秦皮和黃柏清除率低于30%，其余中藥清除率在25%～58%；在5 mg/mL時，陳皮、黃柏的清除率不足5%，其余中藥清除作用效果也較差，總體在7%～28%范圍內。

2.4 中藥復方對·OH 的清除作用

由圖4可知，復方1和復方3的清除作用優(yōu)于復方 2、4和5。在25 mg/mL時，復方1的清除率較高（67.68%），復方5的清除率較低（30.61%）；5 mg/mL 時復方3的清除率最高，為27.87%，復方2的清除率僅為8.51%。復方與其含有的單一中藥比較，復方1整體表現(xiàn)出很好的協(xié)同作用，復方3僅在5 mg/mL和10 mg/mL時清除率高于含有的單一中藥，而復方2、4及5清除率介于組成復方的單一中藥之間，清除作用較差。

2.5 中藥及其復方多糖含量與自由基清除作用的相關性

采用苯酚-硫酸法并根據(jù)葡萄糖標準曲線（A=14.773C-0.036 1，R2=0.997 9，在10～50 μg/mL范圍內呈線性相關）計算測得12種中藥及5個中藥復方多糖含量，以對DPPH·和·OH清除率分別達到50%和25%所需中藥提取液濃度（IC50或IC25）作為衡量清除自由基活性強弱的指標（IC50或IC25值越小，清除作用越強），比較分析多糖含量與對自由基清除作用的關系，結果見表1。由表1可知，12種中藥中白術多糖含量達36.40%，防風、陳皮、黃柏、甘草的多糖含量為7.00%～14.93%，秦皮中多糖含量最低，為0.79%，其余中藥多糖含量為1.61%～4.08%；復方中復方3的多糖含量達31.46%，其余復方中多糖含量范圍為3.12%～6.00%。

12種中藥及復方中對DPPH·的清除率達到50%所需濃度IC50值最小的為秦皮（0.02 mg/mL），白術、防風、黃芪及復方3的IC50值均大于1.00 mg/mL，其余中藥及復方IC50值為0.22～0.82 mg/mL，12種中藥IC50與多糖含量有中度正相關性（r=0.524），中藥復方IC50與多糖含量低度正相關（r=0.400）；12種中藥及復方在濃度范圍內對·OH 清除率不高，以清除率到達25%所需中藥濃度（IC25）表示其清除作用強弱。黃柏IC25值最大，其余中藥及復方IC25在4.744～28.493 mg/mL范圍內。12種中藥及復方IC25與多糖含量基本不相關（r1=0.109，r2=-0.300）。

3 小結與討論

DPPH·是以氮為中心的穩(wěn)定自由基，如果受試物能清除DPPH·，表明受試物具有清除氧自由基、烷自由基或阻斷脂質過氧化鏈反應的作用[16]。DPPH法已被廣泛用于評價受試物體外抗氧化活性，并且該方法簡便、重復性好。本研究發(fā)現(xiàn)12種中藥中秦皮、白頭翁、黃連及黃柏對DPPH·清除作用較好，白術和黃芪清除作用較差；動物體內產生的自由基95%以上都是氧自由基，·OH自由基作為最具代表性的氧自由基，極其活潑，反應速率快 ，可損傷蛋白質、脂質以及核酸等生物大分子[17]。本研究結果表明，白術、刺五加、防風、魚腥草清除·OH效果相對較好，秦皮和黃柏作用效果相對較差。不同中藥對自由基的清除作用表現(xiàn)較大差異，趙駿等[18]研究的20種中藥水提液在4 mg/mL時對自由基的清除率為22.6%～94.1%，差異較大。

復方1、2、4和5對DPPH·清除作用較好，在1 mg/mL時清除作用與維生素C相接近，并且復方1、2、4和5在0.8、1.0 mg/mL時表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化作用；復方1和3對·OH清除作用較好，復方1整體表現(xiàn)出很好的協(xié)同作用，復方3僅在5 mg/mL和10 mg/mL時表現(xiàn)一定程度的協(xié)同抗氧化作用。這些復方表現(xiàn)出協(xié)同抗氧化效應可能是復方中含有多種中藥多糖或與其他活性成分協(xié)同作用的結果，其作用機制有待進一步明確[19，20]。

據(jù)報道，中藥抗氧化的主要活性成分有多糖類、黃酮類、酚類以及皂苷類化合物[21]。多糖類化合物對自由基的清除作用國內外均有報道，Maity等[22]的報道表明蘑菇多糖對DPPH·有較好的清除作用，且對自由基的清除率隨多糖含量升高而增大。胡飛等[23]的研究也表明苦瓜多糖對DPPH·和超氧離子具有顯著清除作用，清除率與多糖呈正相關的量效關系。本研究同樣發(fā)現(xiàn)同一種中藥或復方對DPPH·和·OH的清除作用隨著水提物多糖含量升高而增大。然而，不同中藥或復方清除DPPH·作用與其多糖含量沒有明顯的相關性，即多糖含量高的中藥或復方并不具有較高的清除DPPH·能力，對·OH的清除作用也基本與多糖含量不相關。這可能是因為中藥多糖存在結構多樣性，不同多糖在組成及結構上的不同可能導致對自由基清除作用的較大差異。

綜合分析，12種中藥及5個復方都有一定的清除DPPH·和·OH的能力，能有效地減少機體自由基氧化損傷。

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