四川獼猴桃潰瘍病的發(fā)生與病原研究

摘要：實地調(diào)查四川5市（縣）獼猴桃（Actinidia chinensis）發(fā)病情況，從發(fā)病果園采集染病枝條并分離病原菌，進行致病性測定，以細菌常規(guī)鑒定及基于16S rDNA序列的分子生物學鑒定等確定病原菌。病害調(diào)查顯示染病獼猴桃枝干上形成滲出白色或紅褐色黏液的潰瘍；葉片上常形成帶黃暈的不規(guī)則暗褐色病斑，且名山和蒼溪兩地的發(fā)病情況比起其他三地更為嚴重。從病枝中分離到5株優(yōu)勢菌株，經(jīng)鑒定為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudmonas syringae pv. actinidiae）。病害調(diào)查中觀察到的癥狀與細菌性潰瘍病癥狀相似，分離得到的病原菌與國內(nèi)其他地區(qū)的報道一致。

關鍵詞：獼猴桃；潰瘍??；丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種；病原菌；四川

中圖分類號：S436.634 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）20-4937-05

Occurrence and Pathogen Identification of Kiwifruit Bacterial Canker in Sichuan

LIU Yao1，ZHU Tian-hui1，F(xiàn)AN Fang-bing1，SHAO Bao-lin1，2

（1. College of Forestry， Sichuan Agricultural University， Ya’an 625014， Sichuna，China；

2. Sichuan Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Chengdu 610041， China）

Abstract： By investigating the occurrence of kiwifruit bacterial canker in five cities and counties in Sichuan province， pathogenic bacteria was isolated from infected trunks of kiwifruits collected from kiwifruit orchard and identified with the pathogenicity test， bacteriological study and molecular identification based on the 16S rDNA sequences. Disease survey showed that the irregular dark brown spots surrounded with yellow halos were often formed on the infected kiwifruit leaves cankers with white or reddish-brown exudates were shaped on the infected trunks， leaders and twigs. The occurrence of disease in Cangxi and Mingshan was more serious than those in the other three places. Furthermore， five isolates of the pathogenic bacteria were obtained and identified as Pseudmonas syringae pv. actinidiae. The symptoms observed in the investigation were similar to the symptoms of bacterial canker and the isolates were also consistent with previous reports in other regions of China.

Key words： Kiwifruit； bacterial canker disease； Pseudomonas syringae pv. actinidiae； pathogen； Sichuan

獼猴桃潰瘍病是一種具有毀滅性的細菌性病害，于20世紀80年代早期在日本和美國被發(fā)現(xiàn)并作了較為詳細的報道[1，2]。隨后，此病相繼在韓國、伊朗、意大利等國出現(xiàn)[3-5]。在中國，該病最早發(fā)現(xiàn)于湖南[6]，之后便迅速蔓延至四川、安徽、福建等省[7-9]。該病害主要危害獼猴桃（Actinidia chinensis）的新梢、側(cè)枝、主干及葉片，造成枝蔓枯死，嚴重時甚至整株枯死，不僅降低獼猴桃產(chǎn)量，而且導致果皮厚、果酸、果色差，果實品質(zhì)降低，果樹樹勢變差，嚴重制約獼猴桃種植。該病于1996年被列為國內(nèi)森林植物病害檢疫對象[10]。近年來，四川多地大力發(fā)展獼猴桃產(chǎn)業(yè)，建立起規(guī)模較大的種植園區(qū)，但是獼猴桃潰瘍病的發(fā)生一直伴隨著整個產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為了更好地在四川地區(qū)檢疫和防治該病，本研究在實地病害調(diào)查基礎上，采集5地染病枝條，分離鑒定引起該病的病原菌，以期為后續(xù)防治工作提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 病害調(diào)查與病枝采集

實地逐株調(diào)查四川省都江堰市、蒼溪縣、崇州市、德陽市以及名山縣主要獼猴桃栽培區(qū)病害發(fā)生情況，記錄發(fā)病癥狀、發(fā)病率、調(diào)查時間和地點等，并從發(fā)病果園采集染病的枝條。

1.2 病原菌分離

病原菌分離的培養(yǎng)基采用牛肉膏蛋白胨（BPA）培養(yǎng)基（牛肉膏3 g/L，蛋白胨10 g/L，蔗糖10 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0）。

將各地采集到的發(fā)病枝條洗凈后，于新鮮病健交界處切取4 mm×4 mm的小塊帶病斑的組織，用無菌水沖洗3次后分別用75%的乙醇和0.5%～1.0%的次氯酸鈉進行表面消毒，病組織在消毒液中浸泡1～2 min，再用無菌水沖洗3次后移至裝有無菌水的培養(yǎng)皿中，制成菌懸液涂布BPA培養(yǎng)基，25 ℃培養(yǎng)1～2 d后挑取單菌落在BPA培養(yǎng)基上多次劃線純化，將純化后的分離菌株轉(zhuǎn)至BPA斜面培養(yǎng)基上4 ℃保存。

1.3 標準菌株和對照菌株

標準菌株為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae），對照菌株為丁香假單胞桿菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv. syringae），二者均由中國林業(yè)科學院森林生態(tài)環(huán)境與保護研究所提供。標準菌株主要用于生理生化指標測定時與待測菌株進行對比；對照菌株主要用于寄主致病性測定時與待鑒定菌株進行對比。

1.4 致病性測定

1.4.1 煙草過敏性反應測定 將從獼猴桃病枝上分離到的5株測試菌株在BPA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)48 h，用無菌水配制成1×109 CFU/mL的菌液，用6號醫(yī)用一次性注射器吸取菌液，對5～6葉齡的煙草葉片進行下表皮皮下滲入，每個菌株接3株共9片葉，以無菌水為對照，25 ℃下保濕培養(yǎng)24 h后觀察其過敏性反應。

1.4.2 對獼猴桃的致病性測定 將采自四川省雅安市多營鎮(zhèn)的獼猴桃離體帶葉枝條插于清水中，接種時先用70%乙醇對枝條表面消毒，然后用I號昆蟲針5根捆成一束蘸取在BPA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d的細菌懸液針刺接種，每個菌株分別接3根枝條，每根枝條接2個位置，以無菌水和丁香假單胞桿菌丁香致病變種作為對照。接種后套袋15 ℃保濕培養(yǎng)，逐日觀察發(fā)病情況。待發(fā)病后，從發(fā)病組織進行病菌再分離，以完成柯赫氏法則的要求，獲得的純培養(yǎng)分離菌株用于細菌學性狀測定。

1.5 細菌學性狀測定

1.5.1 病原菌形態(tài)特征和染色反應 細菌的形態(tài)觀察采用透射電鏡技術。將供試菌株用無菌水配制成濃度為1×107 CFU/mL的菌液，滴1滴于銅網(wǎng)上，室溫下吸附5 min，濾紙吸干，再加11%磷鎢酸負染1～2 min，吸去多余液體，待干后于日立H-600型透射電鏡下觀察菌體形態(tài)、鞭毛數(shù)目和著生位置。同時按常規(guī)進行革蘭氏染色、莢膜染色和芽孢染色，置于光學星微鏡下觀察。

1.5.2 培養(yǎng)性狀觀察 供試菌株在BPA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)2 d后觀察菌落的性狀特點。

果聚糖產(chǎn)生試驗：配制含蔗糖培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，蔗糖 50 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2）和含葡萄糖培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖 50 g/L，瓊脂20 g/L，pH 7.0～7.2）。分別在兩種培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，觀察菌落形態(tài)。

KBA產(chǎn)熒光試驗：供試菌株在KBA培養(yǎng)基（甘油 10 g/L，胰蛋白胨20 g/L，K2HPO4 1.5 g/L，MgSO4·7H2O 1.5 g/L，瓊脂 20 g/L，pH 7.2）上培養(yǎng)3 d后在紫外燈下觀察。

1.5.3 病原菌生理生化測定 主要生理生化測定參照文獻[11]、[12]等進行，以無菌水和標準菌株作對照。

1.6 基于16S rDNA序列的分子鑒定

1.6.1 供試菌株基因組DNA提取 挑取純化后的單菌落移植至LB液體培養(yǎng)基（胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，NaCl 10 g/L），25 ℃下250 r/min搖床培養(yǎng)過夜。然后使用天根生化科技有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒提取各參試菌株的基因組DNA。

1.6.2 供試菌株16S rDNA序列的PCR擴增 根據(jù)已發(fā)表的植物病原細菌16S rDNA通用引物[13]（27f：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -3′；1492r：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）對各供試菌株進行PCR擴增。PCR反應體系總體積為50 μL，含25 μL Premix Taq（日本寶生物工程有限公司），2 μL引物27f，2 μL引物1492r，5 μL DNA模板，ddH2O補足總體積。反應混合液在95 ℃預變性4 min；94 ℃變性1 min，56 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。反應結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物在1.5%的瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測，檢測后將PCR產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司測序。

1.6.3 序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 將獲得的測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進行BLAST同源序列比對，從中選取相似序列，使用MEGA 4.0和Clustral X軟件完成序列匹配，采用鄰接法進行聚類分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 調(diào)查地病害發(fā)生情況及比較

2011年3月中下旬至4月下旬進行實地癥狀觀察，圖1、圖2分別顯示的是名山縣和蒼溪縣病株潰瘍病的發(fā)病癥狀。病株的分枝處表現(xiàn)出典型的潰瘍病腐爛癥狀，發(fā)病部位裂縫及其附近區(qū)域顏色均轉(zhuǎn)為赤褐色，從裂縫及鄰近病斑的皮孔處分泌出大量菌滲物，菌滲物為淡褐色膠狀黏性液體，流膠處的樹皮也變成黑色。細心觀察，可以發(fā)現(xiàn)病部周圍還存在白色小粒狀菌露。

標本觀察。圖3、圖4和圖5分別為采自崇州市、德陽市和都江堰市的病株標本，這些病株的病部出現(xiàn)許多赤銹色的小點，其皮層組織也呈赤褐色。剝開樹皮，可見到褐色壞死的導管組織及其鄰近的變色區(qū)，皮層被侵染后皺縮干枯；病株上形成1 mm×3 mm左右的裂縫，周圍漸轉(zhuǎn)為愈傷組織。

葉片發(fā)病后（圖6）先形成紅色小點，外圍可見不明顯的黃色暈圈，后形成2～3 mm不規(guī)則的褐色到暗褐色病斑，可見寬約2～5 mm的明顯黃暈，潮濕條件下擴大成多角形水漬狀大斑。

經(jīng)統(tǒng)計，5個調(diào)查地中蒼溪、名山兩地發(fā)病嚴重，發(fā)病率達30%～40%，而其他3地發(fā)病相對較輕，發(fā)病率為15%左右。究其原因可能是由于蒼溪縣相對于崇州市、德陽市和都江堰市3個四川中部城市處在偏東北的山地，山地相對于中部盆地更為冷濕，冬寒夏涼，年均溫低于中部地區(qū)；名山縣地處四川偏西南地區(qū)，也處在山地，且常年多雨，年均溫同樣低于這3地，而獼猴桃潰瘍病最易在陰冷潮濕的環(huán)境中發(fā)生。因此推測氣候、地理原因可能是造成兩地區(qū)發(fā)病更為嚴重的主要原因。

2.2 獼猴桃潰瘍病病原菌分離

從采集的病株樣本中共分離得到12株疑似病原菌菌株，選取其中典型的5株作為供試菌株，將其編號為DY10、CX9、DJY33、CZ8、MS16。

2.3 致病性測定

2.3.1 煙草過敏反應 煙草過敏反應測定結(jié)果（圖7）顯示，煙草葉片接種供試菌株24 h后，全部出現(xiàn)枯斑，證明有過敏反應。初步表明供試菌株具有致病性。

2.3.2 對獼猴桃的致病性測定 對獼猴桃的致病性測定結(jié)果（圖8）表明，供試菌株接種到獼猴桃枝干上9～16 d后，接種處出現(xiàn)明顯的染病癥狀，其具體特征是在枝干接種處病變，流出黃色汁液，隨后顏色由淺變深，最后變成深紅和銹紅色，這是菌溢體氧化的結(jié)果。感病部位韌皮部細胞壞死，組織褐變，芽體不發(fā)，枝條枯干。分離病組織，然后重新回接到獼猴桃枝條上，其表現(xiàn)出相同的癥狀。對照株接種點未見發(fā)病。

2.4 細菌學性狀

2.4.1 細菌形態(tài)特征和染色反應 透射電鏡和革蘭氏染色反應的鏡檢（圖9）表明，菌體為短桿狀，少數(shù)稍彎曲，大小為1.46～2.30 μm×0.35～0.50 μm，多數(shù)1根鞭毛，極生，少數(shù)為2～3根。病原菌革蘭氏染色為陰性，不具莢膜，不產(chǎn)生芽孢。

2.4.2 培養(yǎng)性狀的觀察 在BPA培養(yǎng)基上，菌落圓形，略微隆起，乳白色，邊緣全緣，表面光滑，半透明；菌落生長速度較慢，培養(yǎng)24 h菌落僅有針尖大，培養(yǎng)36 h菌落直徑為0.75～2.02 mm；在KBA培養(yǎng)基上不產(chǎn)生熒光；在蔗糖培養(yǎng)基上菌落為黏液狀，表明有果聚糖產(chǎn)生。

2.4.3 病原菌生理生化反應 病原菌生理生化反應試驗結(jié)果見表1。5株供試菌株的氧化酶試驗、精氨酸雙水解酶試驗和馬鈴薯軟腐試驗結(jié)果均顯示為陰性，無冰核活性，產(chǎn)氨，耐鹽力為3%～4%，不液化明膠，不能使硝酸鹽還原，石蕊牛乳反應呈弱堿性，能利用相同的糖類和氨基酸。所有生理生化指標測試結(jié)果均與標準菌株一致。

2.5 基于16S rDNA序列的分子鑒定

按照1.6.1的方法提取各供試菌株的基因組DNA，電泳檢測提取的DNA樣品，條帶高亮清晰無拖尾現(xiàn)象，表明DNA質(zhì)量較高，可直接用于PCR反應。用16S rDNA通用引物擴增參試菌株DNA，得到大小約為1 500 bp的清晰條帶，符合預期大小，擴增特異性較高。通過對測序結(jié)果進行BLAST同源比對，結(jié)果顯示供試的5個菌株的16S rDNA序列與NCBI網(wǎng)站上的PSA菌株（GenBank AB001439.1）同源性都達到99%以上。從GenBank中選取相似菌株利用MEGA4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖10），結(jié)果表明5株供試菌株在同一分支上，并與NCBI數(shù)據(jù)庫中的標準菌株PSA聚為一類，且置信度達89%。這也說明5株供試菌株并沒有因地理位置的不同而產(chǎn)生遺傳分化。

3 小結(jié)與討論

國內(nèi)外對獼猴桃潰瘍病的病原有很多研究報道。1983年，美國的Opgennorth[2]經(jīng)過鑒定確定該病的病原菌為丁香假單胞菌李致病變種（Pseudomonas syringae pv. morsprunorum）。1984年，日本曾報道丁香假單胞菌丁香致病變種（Pseudomonas syringae pv. syringae）為獼猴桃潰瘍病的病原菌[1]。1989年，日本的Takikawa等[14]將病原菌認定為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種（Pseudomonas syringae pv. actinidiae）。Pseudomonas syringae pv. morsprunorum致病菌對獼猴桃的致病力比較弱，接種后產(chǎn)生的潰瘍癥狀不明顯，而Pseudomonas syringae pv. actinidiae對獼猴桃有較強的致病力，除了在枝蔓上接種能夠表現(xiàn)出典型的潰瘍病癥狀外，在花及葉片上也能致病，表現(xiàn)出潰瘍病的癥狀。此后，王忠肅等[15]、梁英梅等[16]和承河元等[8]分別對四川、陜西和安徽的獼猴桃潰瘍病進行病原鑒定，也認為其病原為丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種。前人研究表明，引起獼猴桃潰瘍病的病原細菌的致病變種有不同，這可能與地理分布有關。近年來國內(nèi)外的報道都傾向于將獼猴桃潰瘍病的病原菌確定為Pseudomonas syringae pv. actinidiae[4-9]，不僅從形態(tài)學、生理生化方面得到了驗證，更為重要的是得到了分子層面的佐證[17，18]。本研究從四川省5市（縣）獼猴桃果園的染病獼猴桃枝條中分離到的病菌對獼猴桃致病力強，一些關鍵的生理生化指標及形態(tài)特征、染色反應、致病性測定和分子鑒定均與國內(nèi)外報道的丁香假單胞菌獼猴桃致病變種一致。研究結(jié)果表明，引起四川獼猴桃潰瘍病的病原菌為丁香假單胞菌獼猴桃致病變種。

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