硫素水平對(duì)韭菜硝酸鹽累積和氮代謝關(guān)鍵酶活性的影響

摘要：以日光溫室多年生韭菜新世紀(jì)雪韭為試材，研究了土壤不同硫磺（S）施用量對(duì)韭菜硝酸鹽含量、氮代謝關(guān)鍵酶活性和葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的調(diào)控效應(yīng)。結(jié)果表明，隨著硫磺施用量的增加，韭菜葉片硝酸鹽含量呈先減少后增加的趨勢(shì)，當(dāng)硫磺施用量為7.2 kg/hm2時(shí)硝酸鹽含量最低，較對(duì)照減少7.2%；韭菜產(chǎn)量、硝酸還原酶（NR）活性、PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、電子傳遞速率（ETR）和葉綠素含量則表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)，均以硫磺施用量7.2 kg/hm2時(shí)達(dá)到最大值，其中NR活性和ETR分別比對(duì)照提高了10.7%和25.8%；另外，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）活性隨硫磺施用量的增加呈逐漸增加的趨勢(shì)，硫磺施用量為54.0 kg/hm2時(shí)，GPT和GOT的活性達(dá)到最高，分別比對(duì)照增加了22.5%和9.4%。

關(guān)鍵詞：硫磺；韭菜；硝酸鹽累積；氮代謝關(guān)鍵酶

中圖分類號(hào)：S633.3；S147.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）20-4882-04

Effects of Sulphur Levels on Nitrate Accumulation and Nitrogen Metabolism Activities of Key Enzymes in the Leaves of Chinese Chive

XIE Xin1，DUAN Li-xiao2，WANG Jun-ling3，GAO Zhi-kui1

（1. College of Horticulture， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China；2. Baoding Institute of Strawberries， Baoding 071000，Hebei，China；3. College of Life Sciences， Agricultural University of Hebei，Baoding 071001，Hebei，China）

Abstracts： The regulatory effects of soil concentration of sulfur processing on nitrate content， nitrogen metabolism activities of key enzymes and chlorophyll fluorescence parameters in the leaves of Chinese chive were studied in sunlight greenhouse. The results showed that the nitrate content first decreased and then increased with the increase in the sulfur concentration. When the sulfur concentration was 7.2 kg/hm2， the nitrate contend was the lowest and then decreased by 7.2% compared with the control. The production， nitrate reductase（NR） activity， PSII maximum quantum yield （Fv/Fm）， electron transport rate（ETR） and chlorophyll content of Chinese chive showed a decreasing trend after the first increase. The maximum was in sulfur concentration of 7.2 kg/hm2 comparing with the control. NRA and ETR increased 10.7% and 25.8%， respectively. In addition， glutamate pyruvate transaminase（GPT） and glutamate oxaloacetate transaminase（GOT） activity showed a gradual increase trend with the increase of S concentration. When concentration of S was 54.0 kg/hm2， GPT and GOT activity reached the highest level and increased by 22.5% and 9.4% comparing with the control.

Key words： Sulfur； Chinese chive； nitrate accumulation； nitrogen metabolism activities of key enzymes

蔬菜容易富集硝酸鹽[1]，其富集的過量硝酸鹽危害人體健康，且日益受到人們的關(guān)注，普遍認(rèn)為蔬菜硝態(tài)氮吸收大于還原是產(chǎn)生硝酸鹽累積的根本原因[2，3]。為了限制硝態(tài)氮的吸收，目前國內(nèi)外的一些研究與生產(chǎn)中，以減控氮素供應(yīng)量來調(diào)控[4]，雖然顯著降低了硝酸鹽的累積，但導(dǎo)致蔬菜不同程度的減產(chǎn)和品質(zhì)的下降。

近年來，由于作物復(fù)種指數(shù)的提高，加之不含硫的高濃度肥料的普遍應(yīng)用，使得越來越多的國家和地區(qū)出現(xiàn)了土壤缺硫情況[5-9]，缺S脅迫會(huì)阻礙N代謝及蛋白質(zhì)的合成，引起植株體內(nèi)N中間產(chǎn)物（硝態(tài)、氨基態(tài)等）的積累，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)含量的降低[10，11]。施硫可顯著降低土壤的pH，有利于減少土壤氨的揮發(fā)[12]，增加土壤含氮量，同時(shí)能有效抑制NH4+向NO3-的轉(zhuǎn)化[13]，從而降低硝酸鹽的累積，但降低程度和土壤中硫的施用量有關(guān)[14，15]。吳曦等[14]研究表明，土壤中施適宜的硫磺可明顯降低油菜體內(nèi)NO3--N含量，提高硝酸還原酶活性，硫磺用量過高時(shí)會(huì)抑制油菜的生長(zhǎng)。過量施用硫磺會(huì)引起土壤中SO42-濃度過高，從而抑制植物根系對(duì)NO3-、HMoO4和H2BO3的吸收，誘發(fā)植株體內(nèi)硝酸還原酶的重要組分Mo和B的缺乏，降低植株體內(nèi)硝酸還原酶活性。因此，篩選土壤中的適宜硫施用量對(duì)降低硝酸鹽累積，提高蔬菜品質(zhì)有著重要的意義。

本研究針對(duì)韭菜生產(chǎn)中硝酸鹽累積問題，基于氮-硫代謝的偶聯(lián)與相關(guān)平衡關(guān)系，分析不同施用量的硫磺對(duì)韭菜葉片硝酸鹽含量、氮代謝相關(guān)酶活性、葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化以及氮代謝產(chǎn)物的影響，篩選出降低韭菜硝酸鹽累積效果顯著的硫磺施用量，探討硫磺降低韭菜硝酸鹽累積的調(diào)控機(jī)制，為綠色蔬菜的栽培提供理論指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與處理

以多年生日光溫室韭菜新世紀(jì)雪韭為試材，試驗(yàn)于2010年2月5日在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)東校區(qū)日光溫室進(jìn)行，農(nóng)藝管理按常規(guī)進(jìn)行。采收前9 d采用硫磺（S）根施，設(shè)5個(gè)處理水平：0.0 kg/hm2（S0）、7.2 kg/hm2（S1）、18.0 kg/hm2（S2）、36.0 kg/hm2（S3）和54.0 kg/hm2（S4），每處理3次重復(fù)。于處理后第 9天進(jìn)行韭菜生理生化指標(biāo)的測(cè)定。

1.2 試驗(yàn)方法

收獲時(shí)每個(gè)處理隨機(jī)抽取10株韭菜單株，測(cè)定地上部的鮮重，之后在105 ℃殺青10 min，再轉(zhuǎn)移到60 ℃烘干至恒重，測(cè)其干重。3次重復(fù)，取平均值。

硝酸鹽含量采用改進(jìn)的紫外差減法測(cè)定[16]，硝酸還原酶（NR）活性采用分光光度法測(cè)定[17]，谷氨酰胺合成酶（GS）活性參照王月福等[18]的方法，谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT） 活性采用吳良?xì)g等[19]的測(cè)定方法，葉綠素含量采用SPAD-502葉綠素計(jì)進(jìn)行測(cè)定?？扇苄缘鞍缀坎捎每捡R斯亮藍(lán)G-250法測(cè)定[17]，游離氨基酸含量采用水合茚三酮法測(cè)定[17]，所有測(cè)定3次重復(fù)，數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行整理、分析和作圖。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定采用德國WALZ公司生產(chǎn)的調(diào)制式熒光成像系統(tǒng)（MINI-IMAGING-PAM）[20]。將韭菜葉片暗適應(yīng)20 min后，在測(cè)量光[強(qiáng)度為0.5 μmol/（m2·s），脈沖頻率為1 Hz]下誘導(dǎo)產(chǎn)生初始熒光（F0），隨后用飽和脈沖光[強(qiáng)度為2 500 μmol/（m2·s），脈沖光時(shí)間為0.8 s]激發(fā)產(chǎn)生最大熒光（Fm）。當(dāng)熒光從最大值降至接近F0水平時(shí)，用光化光[強(qiáng)度為156 μmol/（m2·s）]來誘導(dǎo)熒光動(dòng)力學(xué)，且每隔20 s打開飽和脈沖進(jìn)行熒光參數(shù)Fm′和Fs的測(cè)定。在每個(gè)樣品測(cè)定光誘導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線后，從動(dòng)力學(xué)曲線中導(dǎo)出所需要的參數(shù)數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 硫磺對(duì)韭菜產(chǎn)量和硝酸鹽含量的影響

從圖1可以看出，隨著硫磺施用量的增加，韭菜植株地上部鮮重表現(xiàn)出先上升后下降的變化趨勢(shì)。當(dāng)土壤施硫7.2 kg/hm2時(shí)，韭菜產(chǎn)量為最高，比對(duì)照S0提高了10.6%。反映出適宜硫磺施用量可以促進(jìn)韭菜的生長(zhǎng)，提高產(chǎn)量；另外，從圖1中還可以看出，硫磺處理韭菜葉片的硝酸鹽含量均隨著硫施用量的增加呈現(xiàn)先減少后增加的變化趨勢(shì)，當(dāng)土壤施硫7.2 kg/hm2時(shí)韭菜硝酸鹽含量最低，較對(duì)照S0相比減少了7.2%。

2.2 硫磺對(duì)韭菜氮代謝關(guān)鍵酶NR、GS、GOT和GPT活性的影響

硝酸還原酶（NR）是氮素同化的關(guān)鍵酶，其催化的反應(yīng)是NO3-同化為NH4+的限速步驟。由圖2可以看出，施硫處理能提高NR的活性，但NR活性隨土壤施硫量的增加呈現(xiàn)先升高后降低的變化趨勢(shì)，當(dāng)土壤施硫?yàn)?.2 kg/hm2時(shí)，NR活性最高，比S0提高了10.7%（圖2）。由此可以看出，施硫可以加速氮同化的啟動(dòng)，但硫施用量過高時(shí)，對(duì)NR活性有抑制的作用，可能是硫同化和氮同化競(jìng)爭(zhēng)活化能量的原因。隨著硫施用量的增加，硫磺處理后的韭菜葉片GS活性表現(xiàn)出逐漸升高的趨勢(shì)（圖2）。

谷氨酸草酰乙酸轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和谷氨酸丙酮酸轉(zhuǎn)氨酶（GPT）為2個(gè)重要的轉(zhuǎn)氨酶。硫磺處理后的第9天，隨著硫施用量的增加，GOT和GPT活性均表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢(shì)（圖3），硫施用量為54.0 kg/hm2時(shí)效果最為顯著，比對(duì)照S0分別增加了9.4%和22.5%。

2.3 硫磺對(duì)韭菜葉片葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)的影響

土壤施用硫磺后，韭菜葉片葉綠素a和葉綠素b含量均隨著硫施用量的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)（表1），當(dāng)硫施用量為7.2 kg/hm2時(shí)，硫磺處理的韭菜葉片葉綠素a和葉綠素b含量均達(dá)到最大，比對(duì)照S0分別提高了16.9%、15.5%。從表1中還可看出，土壤施硫處理均可提高韭菜葉片的吸光系數(shù)（Abs），當(dāng)硫施用量為7.2 kg/hm2時(shí)達(dá)到最高，比對(duì)照S0提高了10.2%。當(dāng)硫施用量大于7.2 kg/hm2時(shí)，韭菜葉片Abs隨著硫施用量的增加逐漸下降。

隨著硫施用量的升高，硫磺處理后的韭菜葉片PSII最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（Fv/Fm）、韭菜葉片ETR、韭菜葉片實(shí)際光化學(xué)量子產(chǎn)量Y（Ⅱ）和調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NPQ）均呈現(xiàn)出先增加后降低得趨勢(shì)（表1）。硫施用量為7.2 kg/hm2時(shí)達(dá)到最高，而非調(diào)節(jié)性能量耗散的量子產(chǎn)量Y（NO）呈現(xiàn)出相反的變化趨勢(shì)。

2.4 硫磺對(duì)韭菜氮代謝產(chǎn)物的影響

由圖4可以看出，韭菜葉片可溶性蛋白的含量隨硫施用量的增加而增加，不同水平的硫處理比S0分別提高了13.9%、9.9%、6.6%和5.2%。植物的干物率在一定程度上可以反映出植物在一段時(shí)間內(nèi)的物質(zhì)積累量，不同硫水平下的韭菜幼苗干物率隨著硫施用量的增加表現(xiàn)出先增加后降低的趨勢(shì)（圖4），其中，在硫施用量為7.2和18.0 kg/hm2時(shí)干物率增加效果最為明顯，分別比對(duì)照S0提高了6.86和7.9個(gè)百分點(diǎn)。韭菜葉片中游離氨基酸的含量隨硫施用量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)（圖5），在硫施用量為7.2 kg/hm2時(shí)達(dá)到峰值，為24.5 mg/100 g（FW）。

3 討論

在氮代謝NO3-到蛋白質(zhì)的整個(gè)過程中，NR作為重要的調(diào)節(jié)酶和限速關(guān)鍵酶，調(diào)控整個(gè)氮素還原同化進(jìn)程[21]。NR活性受底物（細(xì)胞質(zhì)內(nèi)硝酸鹽）濃度所誘導(dǎo)[22]，但過量的硝態(tài)氮會(huì)被運(yùn)輸?shù)揭号葜匈A積備用[23]。葉勇等[24]認(rèn)為一定的硫水平能明顯提高硝酸還原酶（NR）的活性，促進(jìn)氮素代謝。本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，NR活性隨著硫施用量的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)，也反映出適宜的硫施用量有促進(jìn)韭菜葉片硝酸還原酶的生成和激活作用，而硫施用量過高反而會(huì)降低NR活性，可能是由于硫素施用量過高會(huì)導(dǎo)致氮硫同化競(jìng)爭(zhēng)活化能量，表現(xiàn)出對(duì)硝酸還原酶的抑制，從而影響植物氮代謝的順利進(jìn)行[25]。提高植物體內(nèi)NR活性從理論上可以提高氮素的利用率，降低蔬菜中硝酸鹽的含量。然而，基因表達(dá)和蛋白質(zhì)水平上的研究方法已經(jīng)表明，酶的總量不是限制胞內(nèi)NR活性的因素，NR在復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上被調(diào)節(jié)。因此，硫?qū)R活性的調(diào)節(jié)機(jī)制還要在分子水平上進(jìn)一步研究。本試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，施硫可提高GS、GOT和GPT活性，說明施硫不僅促進(jìn)了韭菜葉片氮代謝中硝酸鹽的還原與同化，同時(shí)還調(diào)動(dòng)轉(zhuǎn)氨作用的積極協(xié)同配合，促進(jìn)了硝態(tài)氮轉(zhuǎn)化為游離氨基酸和可溶性蛋白，這可能是土壤施硫處理降低韭菜硝酸鹽累積的一個(gè)重要原因。

硫的供應(yīng)水平對(duì)葉綠體的形成和光合作用的改善有重要影響。劉中良等[26]試驗(yàn)研究指出，硫肥可顯著提高大蒜葉片葉綠素含量，增強(qiáng)光合作用。劉麗君等[27]研究表明，施硫能增加大豆葉面積，并顯著提高大豆葉綠素含量，有利于增加產(chǎn)量。朱英華等[28]等研究指出，施用適宜量的硫?qū)煵萑~片光合有效量子產(chǎn)量（EQY）、光合電子傳遞速率（ETR）、光化學(xué)淬滅（qP）有明顯提高作用，高硫或低硫都會(huì)導(dǎo)致煙草EQY、ETR、qP降低和NPQ的升高。本研究結(jié)果亦表明施硫可提高韭菜葉片葉綠素的含量，且適宜施用量的硫磺可促進(jìn)PSⅡ的光能捕獲、吸收與傳遞更多的能量，為氮代謝（如亞硝酸鹽還原和氨同化）和硫代謝（如硫酸鹽還原）等提供充裕的能量，提高光合效率。光合作用的改善對(duì)提高生物累積量、可溶性糖、C-骨架和韭菜的產(chǎn)量奠定了基礎(chǔ)。另外，施用硫磺后韭菜葉片生長(zhǎng)量增大，對(duì)硝態(tài)氮產(chǎn)生了稀釋效應(yīng)，使單位重量蔬菜NO3-的含量下降，從而降低了硝酸鹽的累積。

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