梅花星豬類群種質(zhì)分子特征研究

摘要：利用PCR-RFLP等技術(shù)檢測(cè)了湖北省黃梅縣梅花星類群49頭豬的ESR、FSHβ（影響產(chǎn)仔數(shù)）、 TEF1（生長(zhǎng)速度）、LPIN1、H-FABP（肌內(nèi)脂肪含量），MC4R、CMYA1（背膘厚度）等7個(gè)候選基因的多態(tài)性。結(jié)果表明，梅花星豬類群中上述7個(gè)候選基因均有豐富的多態(tài)性，特別是肌內(nèi)脂肪含量有利基因的基因頻率較高，是其肉質(zhì)優(yōu)良的分子基礎(chǔ)。其他性狀相關(guān)基因的雜合子頻率也較高，通過(guò)和已有的研究對(duì)比，初步分析梅花星豬類群受外來(lái)豬雜化程度嚴(yán)重，本研究為梅花星豬遺傳資源的保護(hù)和利用提供了科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞：梅花星豬；產(chǎn)仔數(shù)；生長(zhǎng)速度；背膘厚度；肌內(nèi)脂肪含量；候選基因

中圖分類號(hào)：S828.8+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3995-04

中國(guó)地大物博，有著豐富的自然氣候和多樣的地形地貌，各個(gè)地方的經(jīng)濟(jì)情況與市場(chǎng)差異大，對(duì)種豬產(chǎn)生了不同的需求，對(duì)外部形態(tài)和生產(chǎn)性能的人工選擇標(biāo)準(zhǔn)不一，加上飼料與飼養(yǎng)管理?xiàng)l件上的差別，從而形成了與當(dāng)?shù)厣鷳B(tài)環(huán)境社會(huì)經(jīng)濟(jì)相適應(yīng)的眾多地方品種。

20世紀(jì)80年代的中國(guó)生豬品種調(diào)查發(fā)現(xiàn)，梅花星豬產(chǎn)于華北和華中地區(qū)之間的過(guò)渡地帶，主產(chǎn)于湖北省黃梅縣和陽(yáng)新縣一帶，湖北的武穴市及蘄春縣、安徽省的宿松縣和江西省的瑞昌縣、武寧縣也有分布。其頭型主要呈現(xiàn)“象鼻頭”，有的豬在額、鼻、尾間、下腹及四肢下端有白毛，其中額部的一小撮是梅花狀白毛，故被稱之為“梅花星豬”。與中國(guó)地方品種一樣，具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、繁殖率高、肉質(zhì)細(xì)嫩香醇等優(yōu)點(diǎn)。1982年，專家赴產(chǎn)區(qū)考察，認(rèn)為主產(chǎn)陽(yáng)新的“陽(yáng)新豬”和主產(chǎn)黃梅的“梅花星豬”屬同一品種，并定名為陽(yáng)新豬。梅花星豬實(shí)際上成為了陽(yáng)新豬的一個(gè)類群。近些年來(lái)，由于外三元商品豬迅猛發(fā)展的沖擊，位于黃梅縣的梅花星豬保種場(chǎng)名存實(shí)亡，梅花星豬的生存受到重挫，瀕臨滅絕[1，2]。黃梅縣五祖鎮(zhèn)的黃梅強(qiáng)立畜牧有限公司歷經(jīng)2年多的努力，從黃梅、宿松、蘄春、柳林等各鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集了100多頭梅花星豬，從而形成了一定規(guī)模的梅花星豬保種群體。

本研究采集了梅花星豬類群中有明顯品種特征的49頭豬個(gè)體的耳組織樣品， 對(duì)與產(chǎn)仔數(shù)（ESR、FSHβ）、生長(zhǎng)速度（TEF1）、肌內(nèi)脂肪含量（LPIN1、H-FABP）和背膘厚度（MC4R、CMYA1）相關(guān)的主要候選基因的多態(tài)性進(jìn)行了檢測(cè)和分析。從分子水平對(duì)梅花星豬進(jìn)行了種質(zhì)特性的評(píng)估，為該豬種的保護(hù)和開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣本采集和基因組DNA提取

采集黃梅縣五祖鎮(zhèn)黃梅強(qiáng)立畜牧有限公司的梅花星豬類群中有明顯品種特征的49頭個(gè)體的耳組織。加入75%乙醇， -20 ℃保存?zhèn)溆?。?氯仿法提取基因組DNA。

1.2 試劑與材料

TaqⅠ、HinfⅠ、BshNⅠ、PvuⅡ限制性內(nèi)切酶，DL 2000 DNA Marker等購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

ESR、FSHβ、TEF1、LPIN1、H-FABP、MC4R、CMYA1基因的引物如表1所示。

1.4 PCR擴(kuò)增

PCR反應(yīng)總體積是10 μL，體系如下：50 ng的基因組DNA，1×PCR Buffer（含Mg2+，TaKaRa），引物終濃度為0.3 μmol/L，dNTPs終濃度為75 μmol/L，Taq DNA聚合酶 1 U。PCR擴(kuò)增程序如下：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50～65 ℃ 30 s（具體退火溫度見(jiàn)表1），72 ℃ 10～90 s（具體延伸時(shí)間根據(jù)目的片段長(zhǎng)度確定，詳情見(jiàn)表1），34個(gè)循環(huán)；最后72 ℃繼續(xù)延伸5 min。

1.5 多態(tài)性檢測(cè)

FSHβ等位基因由片段插入造成， 瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物即可見(jiàn)多態(tài)性。其他6個(gè)基因均采用PCR-RFLP 方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ESR基因

由圖1可知，ESR基因出現(xiàn)了3種基因型。121 bp純合子（AA基因型）；121、 65、56 bp雜合子（AB基因型）；65、56 bp純合子（BB基因型）。梅花星豬類群ESR基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2所示。

2.2 FSH β基因

由圖2可知，F(xiàn)SHβ基因有3種基因型，500 bp純合子（AA基因型）；500、220 bp雜合子（AB基因型）；220 bp純合子（BB基因型）。梅花星豬類群FSHβ基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

2.3 TEF1基因

由圖3可知，TEF1基因有3種基因型，分別為93 bp純合子（GG基因型）、93、118 bp雜合子（AG基因型）、118 bp純合子（AA基因型）。梅花星豬類群TEF1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

2.4 Lpin1基因

由圖4可知，Lpin1基因有3種基因型，分別為316 bp純合子（TT基因型）；316、256 bp雜合子（TC基因型）；256 bp純合子（CC基因型）。梅花星豬類群Lpin1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

2.5 H-FABP基因

由圖5可知，H-FABP基因經(jīng)PCR-RFLP分型后，純合子TT和CC片段大小分別為（319+172+59） bp和（319+231+59） bp，雜合子CT為319 bp和（231+172+59）bp。梅花星豬類群H-FABP基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

2.6 MC4R基因

MC4R基因采用PCR-RFLP進(jìn)行分型檢測(cè)，結(jié)果出現(xiàn)3種基因型（圖6）：480 bp純合子（AA基因型）；480、400 bp雜合子（AB基因型）；400 bp純合子（BB基因型）。梅花星豬類群MC4R基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

2.7 CMYA1基因

CMYA1基因經(jīng)PCR-RFLP分型檢測(cè)，結(jié)果有3種基因型：CC型有4條帶（444+254+206+85）bp，TT型有5條帶（286+254+206+158+85） bp，CT型有6條帶（444+286+254+206+158+85） bp（圖7）。CMYA1基因多態(tài)性檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

3 討論

3.1 Lpin1、H-FABP基因

Lpin1基因是與動(dòng)物機(jī)體脂肪沉積密切相關(guān)的重要候選基因。豬Lpin1基因第2外顯子存在C93T突變，可用TaqⅠ酶切分型，對(duì)于該位點(diǎn)，已有研究表明，在萊蕪豬、沂蒙豬、杜洛克、大白和長(zhǎng)白豬中CC型均為優(yōu)勢(shì)等位基因[3，4]。

H-FABP基因參與脂肪酸代謝，調(diào)節(jié)長(zhǎng)鏈脂肪酸攝取與氧化以及能量代謝平衡，位于5′UTR的T/C突變可被HinfⅠ酶識(shí)別，Han等[5]在大白和通城品種群體中檢測(cè)發(fā)現(xiàn)該基因與肌內(nèi)脂肪含量顯著關(guān)聯(lián)，TT為有利基因型。

本研究在梅花星豬類群中，對(duì)H-FABP基因的檢測(cè)結(jié)果表明，有利基因型均占到多數(shù)，Lpin1基因CC型占到絕大多數(shù)，與我國(guó)地方豬種優(yōu)良的肉質(zhì)性能相吻合，為地方豬種合理開(kāi)發(fā)利用其肉質(zhì)的優(yōu)良特性提供了一定的依據(jù)。

3.2 ESR、FSHβ基因在群體中的多態(tài)性分析

雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR）基因參與并影響著雌激素基因在雌性脊椎動(dòng)物組織中的表達(dá)與調(diào)控。Rothschild實(shí)驗(yàn)室采用候選基因法對(duì)ESR基因進(jìn)行RFLPs分析，發(fā)現(xiàn)了1個(gè)PvuⅡ酶切位點(diǎn)，且等位基因B（含有1條特異的3.7 kb的帶）與高產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)聯(lián)，BB基因型個(gè)體母豬第一胎總產(chǎn)仔數(shù)和產(chǎn)活仔數(shù)都比AA（含有1條特異的4.3kb的帶）基因型個(gè)體多2.3頭（P<0.01），所有胎次多1.5。

促卵泡激素β亞基（Follicle-stimulating hormone-β，F(xiàn)SHβ）基因，序列的+809與+810堿基之間長(zhǎng)度為292 bp，把0.2 kb的擴(kuò)增產(chǎn)物命名為B等位基因，0.5 kb擴(kuò)增產(chǎn)物命名為A等位基因。在民豬、約克夏、長(zhǎng)白豬和杜洛克豬中擴(kuò)增出了3種基因型（AA、AB、BB）。其中B等位基因在長(zhǎng)白豬和約克夏豬中占優(yōu)勢(shì)，等位基因頻率分別是0.819 6和0.907 4，對(duì)其基因效應(yīng)分析發(fā)現(xiàn)BB型母豬比AA型母豬的頭胎平均總產(chǎn)仔數(shù)高2.53頭，平均產(chǎn)仔數(shù)高2.12頭，所有胎次的平均值高出1.5頭[6]。王繼英等[7]分析了萊蕪豬FSHβ基因的多態(tài)性及其與產(chǎn)仔性能的關(guān)系，結(jié)果表明，對(duì)于FSHβ亞基基因，AA基因型占絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，且產(chǎn)仔數(shù)最高。研究發(fā)現(xiàn)不同的群體優(yōu)勢(shì)基因型不同，對(duì)于國(guó)外品種B為有利等位基因，中國(guó)地方豬種A為有利等位基因。

對(duì)梅花星豬類群檢測(cè)結(jié)果顯示，ESR基因BB基因型頻率僅為0.08，B基因頻率為0.33。檢測(cè)結(jié)果與中國(guó)地方豬種高產(chǎn)仔性能不符合，而對(duì)于FSHβ基因，A、B等位基因頻率基本一樣，未表現(xiàn)某等位基因在梅花星豬群體中占有優(yōu)勢(shì)。兩個(gè)基因的檢測(cè)結(jié)果都說(shuō)明該群體受到國(guó)外豬種影響很大，存在一定的雜化情況。目前的梅花星豬群體系從各個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)農(nóng)戶手中收購(gòu)組建而成，農(nóng)戶可能用外源豬和本地豬雜交以獲得更快的生長(zhǎng)速度。由于群體剛剛組建，后續(xù)應(yīng)該在擴(kuò)大群體的基礎(chǔ)上，記錄完善各項(xiàng)數(shù)據(jù)，繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)分子水平的檢測(cè)與選種，以求從遺傳上提純、恢復(fù)固有的高產(chǎn)仔性能潛質(zhì)。

3.3 MC4R、CMYA1基因在梅花星豬類群中的多態(tài)性分析

豬MC4R基因第七跨膜結(jié)構(gòu)域一個(gè)高度保守區(qū)域發(fā)生了一個(gè)錯(cuò)義突變（G→A），產(chǎn)生了TaqⅠ酶切位點(diǎn)，這一突變使MC4R蛋白第298位氨基酸的天冬氨酸被天冬酰胺代替（Asp298Asn）。對(duì)于MC4R基因該位點(diǎn)，劉桂蘭等[8]在大白豬和梅山豬的雜交家系中檢測(cè)顯示AB型為有利基因型，而Kim等[9]對(duì)含有中國(guó)梅山豬血統(tǒng)的豬群檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)BB型為有利基因型，說(shuō)明在不同群體中，MC4R基因所引起的性狀變異大小及作用方式是不盡相同的。

CMYA1的主要功能在人與小鼠的研究報(bào)道上較多，主要在胚胎發(fā)育、肌細(xì)胞的成熟、肌管的生產(chǎn)及肌纖維的發(fā)育等方面起著重要作用。Xu等[10]對(duì)于CMYA1基因Hinf1酶切位點(diǎn)進(jìn)行了檢測(cè)，在通城豬群體檢測(cè)結(jié)果為CMYA1基因與肩部背膘厚顯著關(guān)聯(lián)，有利基因型為CC。

對(duì)于梅花星豬類群的檢測(cè)結(jié)果顯示，MC4R基因有利基因型個(gè)體占絕大多數(shù)，CMYA1基因CC型個(gè)體較其他兩種基因型略多。其中雜合子比例都較高，與ESR、FSHβ檢測(cè)結(jié)果一樣，反映了群體在一定程度上被雜化，有待提純。

3.4 TEF1基因在梅花星豬類群中的多態(tài)性分析

TEF1（TEA DNA binding domain-1）基因是重要的轉(zhuǎn)錄因子，在人和小鼠的心肌和骨骼肌中高表達(dá)，缺失后導(dǎo)致心臟缺失和胚胎致死。Xu等[11]在5′UTR區(qū)發(fā)現(xiàn)G93A突變位點(diǎn)，并通過(guò)性狀關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)該突變位點(diǎn)與平均日增重、腰部背膘厚、三點(diǎn)平均背膘厚和眼肌面積呈顯著關(guān)聯(lián)。且GG型為有利基因型，G基因?yàn)橛欣任换?，?duì)于梅花星豬類群TEF1基因檢測(cè)顯示，GG型個(gè)體占0.4375，而G等位基因比例占到0.656 3，在該群體中比例略有優(yōu)勢(shì)。

本研究限于群體規(guī)模限制，數(shù)量較少，后續(xù)有待擴(kuò)大規(guī)模，并完善數(shù)據(jù)記錄，繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)分子水平的檢測(cè)。梅花星豬類群是從黃梅縣附近各個(gè)鄉(xiāng)鎮(zhèn)收集“梅花星豬”而組建，在收集之前已經(jīng)被一定程度的雜化，后續(xù)需要經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的性能測(cè)定，科學(xué)的選種選配，以及配合相關(guān)分子水平的檢測(cè)，以求恢復(fù)群體的遺傳純度，為保護(hù)中國(guó)地方優(yōu)良生豬品種提供思路和方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 鄭丕留，張仲葛，陳效華，等.中國(guó)家畜家禽品種志[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1986.

[2] 國(guó)家畜禽遺傳資源委員會(huì).中國(guó)畜禽遺傳資源志·豬志[M].北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2011.

[3] ROTHSCHILD M F， LARSON G R， JACOBSON C D， et al. Pvu Ⅱ polymorphisoms at the porcine estrogen receptor lovus （ESR）[J]. Animal Genetics，1991，22（5）：448.

[4] 戈 新，邢晉諱，劉忠琛，等. 6個(gè)豬群lpin1基因多態(tài)性分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2011，24（1）：301-304.

[5] HAN X， JIANG T， YANG H. Investigation of four porcine candidate genes （H-FABP， MYOD1， UCP3 and MASTR） for meat quality traits in Large White pigs[J]. Mol Biol Rep，2012， 39（6）：6599-6605.

[6] 趙要鳳，張 順，李 寧，等.香豬、民豬FSHβ亞基基因位點(diǎn)的多態(tài)性分析[J].遺傳，1997，19（增刊）：27-28.

[7] 王繼英，武 英，張大龍，等.萊蕪黑豬高繁基因的多態(tài)性及其對(duì)產(chǎn)仔數(shù)的影響[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，17（1）：7-10.

[8] 劉桂蘭，蔣思文，熊遠(yuǎn)著，等.豬資源家系MC4R基因掃描及其與脂肪性狀的相關(guān)分析[J].遺傳學(xué)報(bào)，2002，29（6）：497-501.

[9] KIM N， LARSEN T， SHORT G， et al.A missense variant of the porcine melanocortin four receptor（MC4R） gene is associated with fatness，growth and feed intake traits[J].Mammalian Genome，2000，11（2）：131-135.

[10] XU X L，XU X W， PAN P W. Porcine skeletal muscle differentially expressed gene CMYA1： isolation， characterization， mapping， expression and association analysis with carcass traits[J]. Animal Genetics，2009，40（3）：255-261.

[11] XU X W，XING S，DU Z Q，et al. Porcine TEF1 and RTEF1： Molecular characterization and association analyses with growth traits[J]. Comparative Biochemistry and Physiology，2008，150（4）：447-453.