DHA對C2C12細(xì)胞成脂分化過程中相關(guān)基因表達(dá)的影響

摘要：采用胰島素、地塞米松和3-異丁基-1-甲基黃嘌呤聯(lián)合誘導(dǎo)C2C12細(xì)胞分化為脂肪細(xì)胞，誘導(dǎo)分化后加入100 mmol/L二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）。DHA處理8 d后，收集細(xì)胞，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測脂肪分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα和ADD1轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平。結(jié)果表明，C2C12細(xì)胞成脂分化時(shí)添加DHA能顯著上調(diào)PPARγ、C/EBPα和ADD1基因的表達(dá)，并且聯(lián)合添加維生素E后效果更顯著。

關(guān)鍵詞：二十二碳六烯酸（Docosahexaenoic acid，DHA）；C2C12細(xì)胞；過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）；CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）；脂肪細(xì)胞定向分化因子1（ADD1）；維生素E

中圖分類號：Q786；R151.2 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3987-04

隨著人們生活水平的提高，消費(fèi)者對畜禽的肉品質(zhì)提出了更高的要求。研究表明多不飽和脂肪酸（PUFA）會影響畜禽的肉品質(zhì)，如嫩度、多汁性、風(fēng)味等[1]。肌內(nèi)脂肪含量是影響肉品質(zhì)的重要指標(biāo)，而肌內(nèi)脂肪沉積是由一系列與脂肪分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，如過氧化物酶體增殖物活化受體γ（PPARγ）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）和脂肪細(xì)胞定向分化因子1（ADD1）等[2]。二十二碳六烯酸（DHA）屬n-3系多不飽和脂肪酸（n-3 PUFA），是生物膜上重要的組成成分，為動物生長發(fā)育所必須[3]。Kim等[4]研究發(fā)現(xiàn)DHA可抑制小鼠前脂肪細(xì)胞3T3-L1的分化，而孫超等[5]研究發(fā)現(xiàn)DHA可上調(diào)小鼠脂肪組織PPARγ基因和FAS基因的mRNA表達(dá)水平，但ADD1基因的mRNA表達(dá)水平下降。DHA被報(bào)道能抑制豬脂肪細(xì)胞分化中ADD1基因和FAS基因的mRNA表達(dá)[6]，添加抗氧化劑（如維生素E）能阻斷DHA的抑制效應(yīng)[7]。然而，在豬日糧中添加DHA卻發(fā)現(xiàn)能上調(diào)ADD1基因和FAS基因的表達(dá)[8]。

成肌細(xì)胞是骨骼肌的前體細(xì)胞，是一種正常情況下位于成熟肌纖維表面的肌源性細(xì)胞。研究表明，成肌細(xì)胞具有成脂分化的能力[9]。在小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞中，DHA的代謝產(chǎn)物能作為PPARγ的配體，與PPARγ結(jié)合并使其活化[10]，進(jìn)而調(diào)控脂肪酸結(jié)合蛋白2（Ap2）和脂聯(lián)素基因的表達(dá)[11]。為進(jìn)一步探討DHA對成肌細(xì)胞成脂分化過程中脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)的影響，本研究以C2C12細(xì)胞為對象，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測DHA、DHA和維生素E聯(lián)合添加對C2C12細(xì)胞成脂分化過程中脂肪分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα和ADD1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DHA、胰島素、地塞米松、3-異丁基-1-甲基黃嘌呤和二甲亞砜（DMSO）購自Sigma公司；DMEM（高糖）細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清（FBS）、青/鏈霉素（S/P）、胰酶溶液均購自Gibco公司；總RNA提取試劑盒（RNAiso Plus）和反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript？誖RT reagent Kit with gDNA Eraser）購自寶生物工程（大連）有限公司；SsoFast EvaGreen Supermix購自Bio-Rad公司；小鼠成肌細(xì)胞系C2C12細(xì)胞購自美國ATCC菌種中心；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.1.2 培養(yǎng)液 完全培養(yǎng)液，其組成為：DMEM（高糖）細(xì)胞培養(yǎng)液添加10%（V/V）FBS和1%（V/V）雙抗。

1.2 方法

1.2.1 C2C12細(xì)胞的培養(yǎng) C2C12 細(xì)胞培養(yǎng)于完全培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長至約80%時(shí)，去除細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，經(jīng)0.25%（m/V）胰蛋白酶-EDTA溶液消化后，細(xì)胞計(jì)數(shù)，向6孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning公司）接入起始細(xì)胞數(shù)為4×104個(gè)細(xì)胞/孔，每孔2 mL培養(yǎng)液，每隔2 d更換新鮮的培養(yǎng)液。

1.2.2 C2C12細(xì)胞成脂分化 當(dāng)細(xì)胞生長至約80%時(shí)，棄去完全培養(yǎng)液，用PBS緩沖液沖洗3次。加入含10 μg/mL胰島素、1 mmol/L地塞米松和0.5 mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤的成脂分化誘導(dǎo)劑的完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)3 d；再加入含10 μg/mL胰島素的完全培養(yǎng)液培養(yǎng)2 d；然后更換成正常的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，每2 d換液一次，觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴形成情況。

1.2.3 DHA和維生素E對C2C12細(xì)胞成脂分化相關(guān)基因表達(dá)的影響 在C2C12細(xì)胞加入成脂分化時(shí)，同時(shí)添加100 mmol/L DHA或100 mmol/L DHA+7.5 mmol/L 維生素E，共設(shè)3個(gè)處理組：①對照組（PBS緩沖液）；②DHA處理組；③DHA和維生素E處理組。處理8 d后，收集細(xì)胞，提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測脂肪分化相關(guān)基因PPARγ、C/EBPα、ADD1的mRNA表達(dá)變化。

1.2.4 總RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 采用RNAiso Plus試劑法提取細(xì)胞總RNA，采用Beckman Coulter DU 800型核酸蛋白測定儀檢測RNA的濃度和純度。cDNA合成按照PrimeScript？誖 RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒操作說明進(jìn)行，總RNA的量為1 μg，反應(yīng)體系為20 μL，cDNA保存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 各處理組樣品靶基因和內(nèi)參基因GAPDH分別進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測，引物序列見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)在Bio-Rad CFX-96型實(shí)時(shí)熒光定量 PCR儀上進(jìn)行。20 μL反應(yīng)體系為：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）2 μL，上、下游引物各1 μL，DEPC水6 μL，2×SsoFast EvaGreen Supermix 10 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃變性2 min；98 ℃變性2 s，60 ℃退火5 s，共45個(gè)循環(huán)。熔解曲線分析反應(yīng)程序?yàn)樽?0 ℃開始，每1 s升高0.5 ℃直至95 ℃結(jié)束，mRNA相對表達(dá)量采用Pfaffl的方法[12]進(jìn)行分析。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 11.5軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行One-way ANOVA方差分析和Ducan法多重比較，數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞生長至約80%時(shí)開始進(jìn)行誘導(dǎo)分化。誘導(dǎo)分化前細(xì)胞呈梭形，誘導(dǎo)分化3 d后細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，逐漸由梭形變成圓形。

2.2 DHA和維生素E對C2C12細(xì)胞成脂分化過程中PPARγ基因表達(dá)的影響

PPARγ是核受體超家族成員之一，在脂肪細(xì)胞分化中起著重要的調(diào)控作用。DHA處理脂肪細(xì)胞8 d后，收集細(xì)胞提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析各組細(xì)胞中PPARγ基因mRNA表達(dá)的變化（圖1）。從圖1可以看出，與對照組相比， DHA處理組顯著上調(diào)了C2C12細(xì)胞成脂分化過程中PPARγ基因的mRNA表達(dá)水平（P<0.05）。DHA+維生素E處理組同對照組相比，極顯著上調(diào)了C2C12細(xì)胞成脂分化過程中PPARγ基因的mRNA表達(dá)水平（P<0.01）。

2.3 DHA和維生素E對C2C12細(xì)胞成脂分化過程中C/EBPα基因表達(dá)的影響

C/EBPα為脂肪細(xì)胞分化過程中的關(guān)鍵調(diào)控因子，能促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化。在誘導(dǎo)分化第8天收集細(xì)胞提取總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析各處理組細(xì)胞中C/EBPα基因mRNA表達(dá)的變化（圖2）。從圖2可以看出，與對照組相比，DHA+維生素E處理組極顯著上調(diào)了C2C12細(xì)胞成脂分化過程中C/EBPα基因的mRNA表達(dá)水平（P<0.01），DHA處理組則無明顯差異。

2.4 DHA和維生素E對C2C12細(xì)胞成脂分化過程中ADD1基因表達(dá)的影響

ADD1是脂肪細(xì)胞分化過程中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，有研究表明其對脂肪合成的酶起重要的調(diào)控作用[13]。在誘導(dǎo)分化第8天，收集細(xì)胞提總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析各組細(xì)胞中ADD1基因mRNA表達(dá)的變化（圖3）。從圖3可以看出，與對照組相比， DHA+維生素E處理組極顯著上調(diào)了C2C12細(xì)胞成脂分化過程中ADD1基因的mRNA表達(dá)水平（P<0.001），而DHA處理組則無差異。

3 小結(jié)與討論

脂肪細(xì)胞分化是一個(gè)由分化轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的復(fù)雜過程，其中最主要的是C/EBPα家族、過氧化物增殖體活化受體（PPARγ）和脂肪細(xì)胞確定分化依賴因子1（ADDl/SREBPl）。目前大量研究表明，PUFAs能影響脂肪分化相關(guān)基因如PPARγ、ADD1、C/EBPα和FAS的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)脂肪沉積。Luo等[14]研究亞麻子（n-3 PUFA）對豬肌內(nèi)脂肪含量和脂肪分化相關(guān)基因表達(dá)的影響發(fā)現(xiàn)，IMF含量與脂肪分化相關(guān)基因PPARγ、Ap2之間呈極顯著線性相關(guān)（P<0.01）。這表明n-3 PUFA能通過影響脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)而影響IMF含量。

成肌細(xì)胞來源于胚胎的中胚層，其在適宜的成脂誘導(dǎo)條件下，能夠定向分化成脂肪細(xì)胞[9]。DHA是機(jī)體必需的PUFAs，為高不飽和脂肪酸，具有強(qiáng)氧化性，其鏈中雙鍵易受自由基攻擊而引起脂質(zhì)過氧化作用，造成細(xì)胞膜功能的損害[15]。研究表明，添加DHA能增加機(jī)體自由基產(chǎn)生，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，產(chǎn)生大量的脂質(zhì)過氧化物，如MDA、酮基等[16]。維生素E是一種具有抗氧化作用的維生素，可通過增加自身的抗氧化能力而減少細(xì)胞的凋亡[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，DHA+維生素E處理組效應(yīng)要強(qiáng)于DHA處理組，能極顯著影響脂肪分化相關(guān)基因PPARγ、ADD1和C/EBPα的表達(dá)。結(jié)果表明，DHA具有一定的氧化特性，該氧化作用能一定程度上被維生素E所緩解。

綜上所述，DHA能促進(jìn)脂肪分化相關(guān)基因的表達(dá)，且DHA+維生素E聯(lián)合添加效果更佳，推測DHA可能具有促進(jìn)肌內(nèi)脂肪細(xì)胞分化和脂質(zhì)聚積的作用，這將為揭示DHA調(diào)節(jié)動物脂肪沉積的機(jī)理提供理論依據(jù)，同時(shí)為改善畜禽的肉品質(zhì)提供參考資料。

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