廣西莪術(shù)多糖水提工藝優(yōu)化及不同產(chǎn)地多糖含量測(cè)定

摘要：為了優(yōu)化廣西莪術(shù)多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）的水提工藝條件，以CKP含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用正交試驗(yàn)考察料水質(zhì)量比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素對(duì)CKP含量的影響并獲得各條件的最佳組合。以6個(gè)產(chǎn)地CKP含量為考察指標(biāo)，采用優(yōu)化的水提工藝條件提取CKP，用H2O2水浴脫色，用Sevage法除蛋白質(zhì)，用苯酚-硫酸比色法在490 nm波長(zhǎng)下測(cè)定CKP含量。結(jié)果表明，最佳的水提工藝條件為料水質(zhì)量比1∶5、在70 ℃下水提1.5 h，在此條件下，CKP平均含量為0.073 mg/g。6個(gè)不同產(chǎn)地CKP含量的差異較大，上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)的CKP含量最高，為0.073 mg/g，橫縣南鄉(xiāng)鎮(zhèn)的CKP含量最低，為0.031 mg/g。正交試驗(yàn)優(yōu)選的CKP水提工藝條件是科學(xué)可行的，廣西境內(nèi)不同產(chǎn)地的CKP含量存在差異，可為廣西莪術(shù)的資源利用和質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：廣西莪術(shù)多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）；正交試驗(yàn)；水提工藝；不同產(chǎn)地

中圖分類號(hào)：TQ461；R284.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3947-04

廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）是2010年版《中華人民共和國(guó)藥典》收載的3種基原莪術(shù)中的一種，為姜科姜黃屬植物的干燥根莖，為廣西的地道藥材[1]。莪術(shù)的主要有效部位為根和根莖，莪術(shù)的主要活性成分是揮發(fā)油和多糖[2]。莪術(shù)揮發(fā)油具有抗腫瘤、抗炎、抗凝血等作用，已廣泛應(yīng)用于臨床。目前有關(guān)廣西莪術(shù)的研究主要集中在莪術(shù)油的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用開發(fā)上，有關(guān)廣西莪術(shù)多糖（Curcuma kwangsiensis polysaccharide，CKP）的研究報(bào)道較少[3，4]，對(duì)CKP的提取工藝及不同產(chǎn)地的CKP含量的研究目前尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。而大量的研究證實(shí)，CKP具有多方面的藥理活性，包括降血脂、降血糖、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫力、抗氧化和抑菌等作用[5，6]。因此本研究采用正交試驗(yàn)，以CKP含量為檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)廣西莪術(shù)中多糖水提工藝進(jìn)行優(yōu)化，篩選出CKP的最佳水提工藝，在此基礎(chǔ)上對(duì)不同產(chǎn)地的CKP含量進(jìn)行比較研究，為廣西莪術(shù)的生藥品質(zhì)評(píng)價(jià)和開發(fā)利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 UV-2401PC 型紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自日本島津公司，F(xiàn)W177型中草藥萬(wàn)能粉碎機(jī)購(gòu)自天津市泰斯特儀器有限公司，SHJM-1型數(shù)顯恒溫?cái)嚢桦姛崽踪?gòu)自山東省鄄城現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)儀器廠，Hei-VAP型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀購(gòu)自德國(guó)Heidolph公司，80-1型電動(dòng)離心機(jī)購(gòu)自江蘇省金壇市城西曉陽(yáng)電子儀器廠，電子天平購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司。

1.1.2 原料 于2011年11～12月，在廣西境內(nèi)全面野外調(diào)查的基礎(chǔ)上，采集了有代表性的6個(gè)產(chǎn)地的廣西莪術(shù)（玉林市樟木鎮(zhèn)、賓陽(yáng)縣新賓鎮(zhèn)、橫縣南鄉(xiāng)鎮(zhèn)、上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)、靈山縣陸屋鎮(zhèn)、玉林市成均鎮(zhèn)）作為CKP的試驗(yàn)材料。所有樣品經(jīng)桂林醫(yī)學(xué)院生藥學(xué)教研室曾建紅教授鑒定為姜科姜黃屬植物廣西莪術(shù)（Curcuma kwangsiensis S. G. Lee et C. F. Liang）的根莖。采收后將根莖除去雜質(zhì)、去皮、洗凈，晾干備用。

1.2 方法

1.2.1 水提工藝正交試驗(yàn) 根據(jù)浸提理論與實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)，CKP的水提工藝與料水質(zhì)量比、提取溫度和提取時(shí)間等因素密切相關(guān)[7]。為選擇最佳的水提工藝條件，本試驗(yàn)采用L9（34）正交試驗(yàn)，以產(chǎn)于上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)的樣品為試驗(yàn)材料，以CKP提取率為考察指標(biāo)，因素與水平見表1。

1.2.2 CKP含量的測(cè)定

1）供試品溶液的制備。稱取廣西莪術(shù)鮮品100 g，切成片狀，置于1 000 mL圓底燒瓶中，按料水質(zhì)量比1∶5加入去離子水，在70 ℃浸提1.5 h，過(guò)濾，重復(fù)浸提3次，合并濾液，于60 ℃真空濃縮至150 mL。將30 mL 30% H2O2加入濃縮液中，水浴脫色2.5 h，液體顏色變?yōu)榈S色后迅速加熱，除去H2O2，加入去離子水將溶液定容至100 mL。采用Sevage法除去蛋白質(zhì)[8]后，采用傾析法取上清液少許，加入1 mL 2 g/L茚三酮溶液，加熱煮沸1 min，若無(wú)紫色出現(xiàn)，說(shuō)明大部分蛋白質(zhì)已經(jīng)被除去。然后采用傾析法取上清液，加去離子水定容至100 mL，搖勻，即得供試品溶液。

2）標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備。精密稱取于105 ℃干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10.0 mg，置于100 mL容量瓶中，用去離子水溶解并稀釋至刻度，搖勻，制得濃度為0.10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

3）最大吸收波長(zhǎng)的選擇。取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液和供試品溶液各1 mL，分別置于具塞刻度試管中，各加入50 g/L苯酚溶液1.0 mL，混勻，再迅速各加濃硫酸5.0 mL，充分搖勻，放入-4 ℃冰箱中冷卻。另取1 mL的去離子水同上平行操作制得空白對(duì)照液。在300～700 nm范圍內(nèi)掃描，以期找到吸收峰最大的吸收波長(zhǎng)。

4）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、1.0、2.0 mL置于10 mL容量瓶中，加去離子水稀釋至刻度，搖勻。分別精密吸取各溶液1 mL，置于具塞刻度試管中，加入50 g/L苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加濃硫酸5 mL，充分搖勻，放入-4 ℃冰箱冷卻。另取1 mL的去離子水同上平行操作制得空白對(duì)照液。在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)量其吸光度，以濃度（x）對(duì)吸光度（y）進(jìn)行線性回歸，制得標(biāo)準(zhǔn)曲線。按所得標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品CKP含量。

1.2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液1.0 mL，在0、2、4、6、12、24 h內(nèi)，于490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.4 精密度試驗(yàn) 分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品溶液6份，每份1.0 mL，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批號(hào)的廣西莪術(shù)鮮品6份，每份約100 g，切成片狀，平行制備供試品溶液，精密吸取供試品溶液1.0 mL，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。

1.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別稱取已知CKP含量的廣西莪術(shù)鮮品6份，每份約50 g，分別加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，制備供試品溶液。精密吸取供試品溶液1.0 mL，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，回收率=（測(cè)得量-樣品質(zhì)量）/標(biāo)準(zhǔn)品加入量×100%。

1.2.7 不同產(chǎn)地CKP含量的測(cè)定 取6個(gè)產(chǎn)地的廣西莪術(shù)鮮品，每個(gè)產(chǎn)地分別取3份，每份約100 g，切成片狀，樣品按最佳工藝條件提取，制備供試品溶液。精密量取供試品溶液1.0 mL，在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，按回歸方程計(jì)算CKP含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 最大吸收波長(zhǎng)的選擇結(jié)果

在300～700 nm范圍內(nèi)掃描發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液均在490 nm處有最大吸收峰，故選擇490 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：y=0.012 6x+0.229 0，r=0.999 1（n=6），葡萄糖在0.143～2.857 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度呈良好的線性關(guān)系。

2.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)、精密度試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)和加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

穩(wěn)定性試驗(yàn)中吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.16%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。精密度試驗(yàn)中吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.68%（n=6），表明儀器精密度良好。重復(fù)性試驗(yàn)中吸光度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.73%（n=6），表明本試驗(yàn)方法重復(fù)性良好。加樣回收率試驗(yàn)的平均回收率為101.9%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.11%（n=6），表明該方法的回收率較好，結(jié)果見表2。

2.4 水提工藝優(yōu)化結(jié)果

2.4.1 正交試驗(yàn)結(jié)果 由方差分析結(jié)果可知，料水質(zhì)量比、提取時(shí)間、提取溫度3個(gè)因素3個(gè)水平對(duì)CKP含量均有顯著性影響（P<0.05）。由表3可知，各因素對(duì)CKP含量影響為料水質(zhì)量比>提取時(shí)間>提取溫度，水提多糖的最佳工藝條件為A1B2C1，即料水質(zhì)量比1∶5，提取溫度70 ℃，每次提取1.5 h。

2.4.2 最佳工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果 以產(chǎn)于上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)的樣品為試驗(yàn)材料，按優(yōu)選的水提工藝條件進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，即按料水質(zhì)量比1∶5加去離子水，在70 ℃加熱回流提取1.5 h。3次驗(yàn)證試驗(yàn)的CKP含量分別為0.071、0.075、0.074 mg/g，CKP平均含量為0.073 mg/g，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.27%。說(shuō)明優(yōu)選的水提工藝條件穩(wěn)定、合理、可行。

2.5 不同產(chǎn)地CKP含量的測(cè)定結(jié)果

由表4可知，CKP含量從高到低的產(chǎn)地依次為上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)、靈山縣陸屋鎮(zhèn)、玉林市樟木鎮(zhèn)、玉林市成均鎮(zhèn)、賓陽(yáng)縣新賓鎮(zhèn)、橫縣南鄉(xiāng)鎮(zhèn)。6個(gè)不同產(chǎn)地的CKP含量存在差異。

3 小結(jié)與討論

目前，對(duì)于廣西莪術(shù)的研究和利用主要集中在莪術(shù)油的基礎(chǔ)研究和臨床研究上，而對(duì)于含量較高的莪術(shù)多糖的研究較少，因此，開展廣西莪術(shù)多糖的研究具有較廣闊的前景。影響中藥浸提的因素很多，包括粉碎度、提取溫度、提取時(shí)間、濃度、pH、溶劑量、壓力等[9]。植物多糖提取率受提取時(shí)樣品的狀況和提取條件等的影響。提取植物多糖時(shí)，當(dāng)提取液達(dá)到一定溫度時(shí)，多糖會(huì)從藥材浸出，但仍有一部分多糖在細(xì)胞內(nèi)難以浸出，選擇適宜的料水質(zhì)量比可以促使多糖浸出，浸出后的多糖一部分?jǐn)U散，一部分可能仍然吸附在藥材表面，因而選擇適宜的提取時(shí)間和提取溫度，可以使多糖擴(kuò)散達(dá)到平衡[10]。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)是一種高效、快速、經(jīng)濟(jì)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，是通過(guò)多因素多水平來(lái)優(yōu)化的試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。本研究對(duì)料水質(zhì)量比、提取溫度、提取時(shí)間3個(gè)因素在3個(gè)水平上考察了它們對(duì)CKP含量的影響，設(shè)計(jì)了三因素三水平的正交表進(jìn)行試驗(yàn)，大大節(jié)省了時(shí)間和材料，且結(jié)果有代表性，易進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

產(chǎn)地環(huán)境和植物本身的遺傳特性是影響多糖含量的主要因素，采樣季節(jié)和多糖提取工藝也會(huì)影響多糖含量的測(cè)定結(jié)果[11]。本試驗(yàn)對(duì)廣西6個(gè)不同產(chǎn)地的CKP含量進(jìn)行研究，結(jié)果表明，上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)的CKP含量最高，平均含量高達(dá)0.073 mg/g，橫縣南鄉(xiāng)鎮(zhèn)的CKP含量最低，平均含量為0.031 mg/g，表明廣西境內(nèi)不同產(chǎn)地的CKP含量差異較大，產(chǎn)地對(duì)CKP含量的影響較大。由于上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)的CKP含量遠(yuǎn)高于其他產(chǎn)地，在廣西莪術(shù)的規(guī)模化生產(chǎn)中，建議選用上思縣思陽(yáng)鎮(zhèn)的廣西莪術(shù)作為優(yōu)良種質(zhì)，以保證和提高廣西莪術(shù)的藥材質(zhì)量。同時(shí)還要注意到，這種相近產(chǎn)區(qū)不同產(chǎn)地主要活性成分的無(wú)地理規(guī)律的變異模式[12]，是由于每個(gè)產(chǎn)區(qū)取樣過(guò)少產(chǎn)生的還是確實(shí)反映了CKP含量變異的本質(zhì)，需要從遺傳學(xué)、栽培歷史和生態(tài)學(xué)等方面進(jìn)一步探討。

總之，本研究以CKP含量為考察指標(biāo)，通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)選出了影響多糖提取率的主次關(guān)系依次是料水質(zhì)量比>提取時(shí)間>提取溫度。根據(jù)正交試驗(yàn)得出最佳工藝條件為料水質(zhì)量比1∶5、在70 ℃下水提1.5 h，在此工藝條件進(jìn)行提取可使CKP含量達(dá)到0.073 mg/g。正交試驗(yàn)優(yōu)選的水提工藝條件的驗(yàn)證結(jié)果表明，所測(cè)得的CKP含量穩(wěn)定，工藝方法合理可行，為下一步的研究和開發(fā)利用提供了依據(jù)。不同產(chǎn)地的CKP含量的比較結(jié)果表明，不同產(chǎn)地的CKP含量的差異較大，為廣西莪術(shù)藥材產(chǎn)地的選擇及質(zhì)量控制方法提供了一定的依據(jù)。

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