復(fù)合酶輔助提取金銀花葉中黃酮工藝和動(dòng)力學(xué)研究

摘要：為了探索采用恒溫水浴法從金銀花（Lonicera japonica）葉中提取黃酮的最佳試驗(yàn)方法及條件，采用單因素試驗(yàn)考察了酶種類和加入量、攪拌速度、提取溫度、金銀花葉粉末粒度、提取時(shí)間等因素對(duì)黃酮提取率的影響，采用正交試驗(yàn)獲得在復(fù)合酶存在下提取金銀花葉中黃酮的最佳試驗(yàn)條件，并用常規(guī)動(dòng)力學(xué)模型進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，復(fù)合酶的加入有利于金銀花葉中黃酮的提取，其最佳條件為80 ℃、纖維素酶和果膠酶各0.06 g、攪拌速度800 r/min、提取時(shí)間40 min。當(dāng)提取溫度低于353 K，常規(guī)提取受動(dòng)力學(xué)控制；若提取溫度高于353 K，過(guò)程將不再受動(dòng)力學(xué)控制。

關(guān)鍵詞：金銀花（Lonicera japonica）葉；黃酮；復(fù)合酶輔助提?。粍?dòng)力學(xué)

中圖分類號(hào)：R284.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3943-04

金銀花（Lonicera japonica）因含有多種黃酮類化合物而被用作中藥材和功能食品，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，黃酮類化合物可以降低心肌耗氧量，增加冠脈和腦血管血流量，具有軟化血管、降血糖和降血壓等功效，同時(shí)，它還是一種天然的抗氧化劑，可以清除人體中超氧離子自由基，具有抗衰老、增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用[1，2]。目前國(guó)內(nèi)外研究比較多的是從金銀花中提取黃酮，提取研究較多的是用水/乙醇提取、微波輔助萃取、超聲波輔助提取等方法[2]，而對(duì)于產(chǎn)量更大的金銀花葉的研究較少，在相當(dāng)長(zhǎng)的一段時(shí)間里金銀花葉被視為金銀花藥材的副產(chǎn)物而被廢棄掉。實(shí)際上，金銀花葉的抑菌效果與花相同甚至高于花，葉中的黃酮含量高于花，是花中的2.78倍[3]。

廣西有豐富的金銀花種質(zhì)資源，但金銀花葉還沒(méi)得到很好的開(kāi)發(fā)和利用，為了尋找經(jīng)濟(jì)有效的提取方法，嘗試了幾種常規(guī)技術(shù)[4]提取金銀花葉中的黃酮，發(fā)現(xiàn)提取方法、工藝條件對(duì)黃酮的提取率和穩(wěn)定性有較大影響，比如在溶劑的選擇方面，乙醇比水的提取效果好但成本較高，而在相同的條件下，超聲波輔助提取黃酮的平均提取率為2.13%，而恒溫水浴常規(guī)攪拌提取的提取率達(dá)到了3.27%以上，這可能是因?yàn)槿~子比重小，易漂浮于溶劑表面的原因。另外，與金銀花相比，葉子的結(jié)構(gòu)和組成不同，含有大量的纖維和果膠，如果不加酶直接提取，黃酮的提取率較低，添加復(fù)合酶可以破壞纖維和果膠，有利于金銀花葉中黃酮的提取?；谏鲜龅脑囼?yàn)探索和分析，研究采用恒溫水浴法從金銀花葉中提取黃酮，并通過(guò)正交試驗(yàn)獲得其最佳試驗(yàn)方法及條件，獲得過(guò)程的動(dòng)力學(xué)模型，這些研究可為今后實(shí)現(xiàn)從金銀花葉中提取黃酮的工業(yè)化和實(shí)現(xiàn)資源的綜合利用提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

金銀花葉（干品）產(chǎn)自廣西壯族自治區(qū)桂林市，蘆丁對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，其他化學(xué)試劑均為分析純。UV-960紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自澳大利亞GBC公司，JJ-4六連同步（測(cè)速）電動(dòng)攪拌器購(gòu)自江蘇金壇市金偉實(shí)驗(yàn)儀器廠，HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋購(gòu)自金壇市醫(yī)療儀器廠。

1.2 方法

1.2.2 黃酮的提取 取10 g金銀花葉粉末，加20 mL水以及適量的酶，調(diào)節(jié)pH，在適當(dāng)?shù)臏囟?、時(shí)間以及攪拌速度下進(jìn)行提取，過(guò)濾，取上清液0.2 mL于比色管中，加入0.3 mL 50 g/L NaNO2搖勻放置6 min，再加入0.3 mL 100 g/L Al（NO3）3搖勻放置6 min，再加入4 mL 40 g/L NaOH搖勻，再加入無(wú)水乙醇定容到10 mL，放置12 min，用分光光度法測(cè)定黃酮濃度，按照下式計(jì)算黃酮提取率Y。Y=（10×Ct×V）×100%/（0.2×10×1 000）。其中，Ct為待測(cè)液黃酮濃度（mg/mL），V為提取液總體積（mL），公式分子的10 mL為定容的體積，公式分母的0.2 mL為取樣的上清液的體積，公式分母的10 g為金銀花葉粉末的質(zhì)量，1 000是單位換算系數(shù)。

1.2.3 動(dòng)力學(xué)模型的選擇 采用文獻(xiàn)[5]推導(dǎo)的動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4 單因素試驗(yàn) 選取了影響黃酮提取率的提取溫度、攪拌速度、提取時(shí)間、酶的用量、酶的質(zhì)量比、金銀花葉粉末粒度6個(gè)因素，分別進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各因素對(duì)黃酮提取率的影響。①提取溫度的影響。分別選取50、60、70、80、90、100 ℃作為提取溫度進(jìn)行試驗(yàn)，其他條件為用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水、0.06 g纖維素酶和0.06 g果膠酶，轉(zhuǎn)速為800 r/min，提取時(shí)間為50 min。②攪拌速度的影響。分別選取500、600、700、800、900 r/min作為攪拌速度，其他條件為用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水、0.06 g纖維素酶和0.06 g果膠酶，提取溫度為80 ℃，提取時(shí)間為50 min。③提取時(shí)間的影響?？疾觳煌奶崛r(shí)間20、30、40、50、60、70 min對(duì)黃酮提取率的影響，其他條件為用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水、0.06 g纖維素酶和0.06 g果膠酶，轉(zhuǎn)速為800 r/min，提取溫度為80 ℃。④酶的用量的影響。用10 g 0.841 mm的金銀花葉、20 mL水，轉(zhuǎn)速為800 r/min，提取時(shí)間為50 min，改變纖維素酶和果膠酶總的用量，取值0.06、0.08、 0.10、0.12、0.14、0.16 g。⑤酶的質(zhì)量比的影響。改變纖維素酶和果膠酶這兩種酶的質(zhì)量比，分別取0∶1、1∶3、1∶1、1∶3、3∶0，其他條件為提取溫度80 ℃、金銀花葉粉末粒度0.841 mm、酶的用量0.12 g、轉(zhuǎn)速800 r/min、提取時(shí)間50 min。⑥金銀花葉粉末粒度的影響。將曬干的金銀花葉粉碎到不同的程度，篩分成粒度分別為0.147、0.177、0.420、0.841、2.000 mm，其他條件分別是提取溫度80 ℃、纖維素酶和果膠酶各0.06 g、轉(zhuǎn)速800 r/min、提取時(shí)間50 min。

1.2.5 正交試驗(yàn) 根據(jù)以上的單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取5個(gè)因素、各4個(gè)水平進(jìn)行正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可知，隨著提取溫度升高，提取率先升高，在50～70 ℃時(shí)，提取率升高很緩慢，在70～80 ℃時(shí)，提取率升高較快，但90 ℃后提取率快速下降。這主要是因?yàn)樘崛囟壬哂欣趥髻|(zhì)的進(jìn)行，可以加快黃酮向溶劑的擴(kuò)散，但提取溫度超過(guò)90 ℃，水分揮發(fā)速度加快，溶劑減少，阻礙溶質(zhì)的擴(kuò)散，同時(shí)高溫下黃酮的熱穩(wěn)定性下降，兩方面的原因?qū)е曼S酮提取率急劇降低。

2.1.2 攪拌速度的影響 由圖2可知，攪拌速度小于700 r/min時(shí)，提取率隨著攪拌速度的增大而迅速提高，而當(dāng)攪拌速度大于700 r/min時(shí)，提取率隨著攪拌速度的增大而平緩提高，800 r/min后提取率基本保持不變，這是因?yàn)樘崛∵^(guò)程是黃酮從金銀花葉顆粒擴(kuò)散到溶液的過(guò)程，當(dāng)攪拌速度小于800 r/min時(shí)，過(guò)程受外擴(kuò)散控制，當(dāng)攪拌速度大于800 r/min時(shí)，外擴(kuò)散不再是動(dòng)力學(xué)控制步驟，提取率不再受其影響。

2.1.3 提取時(shí)間的影響 由圖3可知，隨著提取時(shí)間的增加，黃酮提取率呈現(xiàn)增加趨勢(shì)，但提取50 min后黃酮提取率變化不大。

2.1.4 酶的用量的影響 由圖4可知，酶的用量越高，黃酮提取率越高，但考慮經(jīng)濟(jì)方面，酶的用量不宜太高，以減少投入的成本。

2.1.5 酶的質(zhì)量比的影響 由圖5可知，只用一種酶不如兩種酶復(fù)合應(yīng)用的效果好，兩種酶復(fù)合應(yīng)用的質(zhì)量比以1∶1的效果最佳。

2.1.6 金銀花葉粉末粒度對(duì)黃酮提取率的影響 由圖6可知，當(dāng)金銀花葉粉末粒度減少時(shí)，黃酮提取率迅速提高，但粒度減小為0.420 mm后，黃酮提取率基本不變，而且粒度越小提取后溶液越難過(guò)濾。綜合考慮取0.420 mm作為金銀花葉的最佳粉末粒度。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表2可知，5個(gè)因素對(duì)黃酮提取率的影響為：提取溫度>酶的用量>提取時(shí)間>酶的質(zhì)量比>攪拌速度，結(jié)合節(jié)能角度考慮，最佳提取條件是提取溫度80 ℃、酶的用量0.12 g、酶的質(zhì)量比1.00∶1.00、攪拌轉(zhuǎn)速800 r/min、提取時(shí)間40 min。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

利用正交試驗(yàn)中的最佳條件重復(fù)3次試驗(yàn)，得到黃酮提取率分別是4.58%、4.61%、4.62%，平均提取率為4.60%，說(shuō)明正交試驗(yàn)的結(jié)果是可信的。

2.4 提取過(guò)程的動(dòng)力學(xué)分析

3 結(jié)論

在復(fù)合酶存在下采用恒溫水浴法提取金銀花葉中黃酮，各因素的影響為：提取溫度>酶的用量>提取時(shí)間>酶的質(zhì)量比>攪拌速度，最佳提取條件為：提取溫度80 ℃、纖維素酶和果膠酶各0.06 g、攪拌速度800 r/min、提取時(shí)間40 min，黃酮的平均提取率可達(dá)4.60%。當(dāng)提取溫度低于353 K，該提取過(guò)程受動(dòng)力學(xué)控制；若提取溫度高于353 K，該提取過(guò)程將不再受動(dòng)力學(xué)控制。

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