東北蒲公英核型分析與減數(shù)分裂的細胞遺傳學(xué)觀察

摘要：對東北蒲公英（Taraxacum. ohwianum Kitam.）染色體的核型和花粉母細胞減數(shù)分裂行為進行了研究。結(jié)果表明，東北蒲公英染色體為二倍體，染色體數(shù)2n=16，核型公式K（2n）=2x=16=10 m+6 sm，屬于2A型，并觀察到有隨體存在。東北蒲公英的造孢細胞存在大量染色體的特殊情況可能是花粉母細胞的一種獨特形成途徑。此外在終變期只觀察到單價體，在中后期Ⅱ染色體拉向兩極不明顯，這與在高等植物中描述的減數(shù)分裂行為并不完全一致。東北蒲公英四分體為非連續(xù)型胞質(zhì)分離，產(chǎn)生了均勻一致的小孢子。

關(guān)鍵詞：東北蒲公英（Taraxacum. ohwianum Kitam.）；染色體；核型；花粉母細胞；減數(shù)分裂

中圖分類號：S567.21；Q343.2；Q253 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）16-3895-04

東北蒲公英（Taraxacum. ohwianum Kitam.）是菊科（Asteraceae）蒲公英屬（Taraxacum F. H. Wigg.）植物，也是菊科舌狀花亞科（Subfam. Liguliflorae DC.）最進化的類群之一[1]。蒲公英屬全世界約有300多種。中國高等植物數(shù)據(jù)庫中已記錄的、在中國分布的有79個種（包括7個存疑種），廣泛分布于中國的東北、華北、西北及西南各省（區(qū)），其中東北地區(qū)為蒲公英的主產(chǎn)區(qū)[2，3]。東北蒲公英在東北地區(qū)有廣泛的分布，但在收集種子的過程中，發(fā)現(xiàn)東北蒲公英經(jīng)常產(chǎn)生敗育的現(xiàn)象，這種現(xiàn)象是產(chǎn)生此次試驗的動因。蒲公英屬植物的染色體從2x到10x不等，以3x居多；其二倍體進行有性生殖[4]，但多倍體中也存在兼性無融合生殖的情況[5]，由此造成種子敗育的原因不能確定。所以試驗以東北蒲公英為材料，采用根尖壓片確定其體細胞染色體數(shù)目，通過分析其核型和花粉母細胞減數(shù)分裂過程中染色體的行為與變異來判斷東北蒲公英的倍性水平，并進一步分析其種子敗育的原因。在此基礎(chǔ)上進一步探討東北蒲公英雜交親本的育性，以指導(dǎo)遺傳育種工作，尤其在確定種間雜交組合、誘變育種等方面具有重要的指導(dǎo)意義，可為東北蒲公英的品種選育、雜交后代和新品種的鑒定、分類、推廣提供重要的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

東北蒲公英于2008年采集于遼寧省丹東市，栽種于沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)百草園中草藥試驗基地內(nèi)，常規(guī)管理。供試材料于2011年5月在田間采集新鮮植株，抖凈泥土后自來水沖洗至沒有附著物，晾干。將全株樣品交由中國科學(xué)院沈陽生態(tài)研究所李冀云研究員鑒定，確認是東北蒲公英無疑。

1.2 核型分析方法

核型分析采用根尖壓片法。取東北蒲公英根長0.5 cm左右的前端部分，于觀察日的9：00～11：00放入八羥基喹啉溶液中4 h，然后把根尖轉(zhuǎn)移到卡諾固定液（冰乙酸∶無水乙醇=1∶3）中固定12 h以上，取出后保存在70%乙醇中（可長期保存）。用1 mol/L HCl在60 ℃的水浴中解離根尖樣品15 min，去離子水沖洗3次后， 卡寶品紅染色24 h以上，取根尖1～2 mm部分（分生組織）壓片觀察，中性樹膠封片。在Olympus光學(xué)顯微鏡下選取若干個染色體分散良好、著絲點清晰的根尖細胞進行核型分析[6]與核型分類[7]，并照相。

1.3 花粉母細胞減數(shù)分裂的觀察方法

花粉母細胞減數(shù)分裂的觀察采用花藥壓片法。于2011年4月底到5月初這段時間隔天在取樣日的9：30～11：30取東北蒲公英未開的花蕾（直徑0.2～2.0 cm）， 迅速帶回實驗室將花蕾在卡諾固定液中固定24 h，再轉(zhuǎn)入70%的乙醇中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存。制片前取出花蕾樣品，用去離子水清洗3次， 晾干后將花蕾用消毒后的鑷子撕開，最好別損壞里面的小花結(jié)構(gòu)。在操作臺上用鑷子于花序中鑷取3～5朵小舌狀花放于載玻片上，用消毒針將上半部分花冠去掉，只留下半部分的聚藥雄蕊，然后置于酶液（4%纖維素酶與1%果膠酶混合液，用檸檬酸緩沖液溶解）中，在37 ℃水浴鍋中酶解120～150 min，再用去離子水清洗3次后將花藥從中部切開，用鑷子輕輕擠壓，采用卡寶品紅染色法制片，火焰微烤分色，用Olympus光學(xué)顯微鏡鏡檢，統(tǒng)計并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 核型分析

東北蒲公英的染色體為二倍體，試驗中觀察到的根尖細胞染色體數(shù)均為16。用Motic Camera專業(yè)圖像分析軟件對5個根尖細胞典型的中期染色體進行長度測量并計算出核型參數(shù)，結(jié)果見表1。從表1可見，東北蒲公英染色體的核型公式K（2n）=2x=16=10 m+6 sm；染色體組總長為80.4，臂比值大于2的染色體占染色體總數(shù)的12.5%，最長染色體（6.6）與最短染色體（4.1）的比值為1.61（<2∶1），核型分類為2A型。東北蒲公英的根尖細胞染色體形態(tài)見圖1，染色體核型見圖2，染色體核型模式見圖3。

2.2 花粉母細胞減數(shù)分裂觀察結(jié)果

2.2.1 孢原細胞 東北蒲公英花粉母細胞減數(shù)分裂觀察結(jié)果見圖4。從圖4可見，孢原細胞分裂旺盛，體積較大，核大于周圍的其他細胞，細胞質(zhì)也較濃。圖4-1、圖4-2、圖4-3、圖4-4為不同染色體數(shù)目的孢原細胞，這些孢原細胞大小不一，染色體數(shù)目差異非常大，數(shù)量從幾百條到幾十條不等，這與根尖染色體數(shù)目明顯不同。圖4-5、圖4-6、圖4-7為不同細胞核數(shù)目的孢原細胞，數(shù)量從2～5不等。在觀察過程中還發(fā)現(xiàn)了大量的不完整孢原細胞出現(xiàn)的現(xiàn)象，如圖4-3那樣，有一部分染色體分離了出去，就像原始細胞的裂解方式一樣。圖4-8是裂解后形成的造孢細胞，而后進行減數(shù)分裂。

2.2.2 第一次減數(shù)分裂 在減數(shù)分裂前期Ⅰ的細線期，花粉母細胞的核仁里出現(xiàn)解體，著色能力越來越弱。此時的染色質(zhì)螺旋化形成長細絲狀的染色體，呈“花束”狀形態(tài)（圖4-9）。至粗線期時，染色體逐漸縮短變粗，直到終變期（圖4-10），同源染色體還沒有配對，仍然是16條染色體。這與大多數(shù)植物在粗線期完成同源染色體的配對明顯不同，說明東北蒲公英的同源染色體配對要明顯滯后于其他植物；此時染色體還保持單價體的狀態(tài)。在后期Ⅰ（圖4-11）染色體分離，其后可以觀察到2個子細胞之間沒有明顯的細胞板分隔（圖4-12），因此東北蒲公英花粉母細胞的減數(shù)分裂為非連續(xù)性胞質(zhì)分裂類型。

2.2.3 第二次減數(shù)分裂 到前期Ⅱ（圖4-13）細胞核開始解體，形成染色體，從中可以看出2個細胞核的解體速度并不一致。后期Ⅱ（4-14）觀察到姐妹染色單體的分離，隨后染色單體開始解螺旋，又重新形成染色體（圖4-15）。染色體進一步分離到子細胞的兩極（圖4-16、圖4-17），當新的核膜、核仁開始形成時即進入末期Ⅱ。在末期Ⅱ（圖4-18）形成四分體，隨著核與核之間細胞壁的形成，出現(xiàn)十字型四分體（圖4-19）。不斷發(fā)育的小孢子因胼胝質(zhì)壁逐漸解體消失，而被釋放到花藥腔中（圖4-20）。

3 討論

翟大彤等[8]研究表明，蒲公英屬植物的染色體數(shù)為2n=18、22、24、26、32、34、36、37；而其對東北蒲公英的核型分析結(jié)果與王守軍等[9]、王艷等[10]對蒲公英的核型分析支持x=8的結(jié)論一致。蒲公英屬植物通常具有無融合現(xiàn)象，一般高倍性的物種可進行無融合生殖、低倍性的物種進行有性生殖[11]。東北蒲公英的染色體為二倍體（2n=16），那么它應(yīng)該進行有性生殖、異交并具有孢子體自交不親和系統(tǒng)存在[4，12]。這在雜交育種上確定雜交組合時，就應(yīng)以東北蒲公英為母本、其他蒲公英做父本來完成雜交試驗。

花粉母細胞由孢原細胞發(fā)育而來；但在此次試驗中，發(fā)現(xiàn)有些孢原細胞存在大量染色體的現(xiàn)象，其數(shù)量遠遠超過根尖細胞染色體計數(shù)的16條，出現(xiàn)孢原細胞的染色體數(shù)目多于正常的16條染色體可能是由于細胞的裂解所造成的，孢原細胞染色體在裂解后形成細胞核，繼而分裂開來。孢原細胞究竟是形成細胞核后裂解、還是形成染色體后再裂解、或者兩種方式兼而有之還需要進一步通過試驗來證明。由于在試驗中經(jīng)常觀察到染色體缺失的情況，所以我們更傾向于形成染色體后再裂解。但這些含有大量染色體的孢原細胞是怎么形成的、又是如何精確調(diào)控染色體分離的、這種現(xiàn)象在蒲公英屬植物中是否普遍存在等問題，需要進一步詳細試驗來解釋。

Atlagic等[13]認為，小孢子母細胞減數(shù)分裂過程與花粉育性具有相關(guān)性；Luan等[14]發(fā)現(xiàn)染色體配對正常時，會得到比較高的花粉育性及結(jié)實率。試驗過程中東北蒲公英的花粉母細胞減數(shù)分裂可形成單價體，但未觀察到雙價體或者三價體，這與Peter等[15]對二倍體的蒲公英（Taraxacum officinale L.）減數(shù)分裂觀察到的在前期Ⅰ形成8條二價體的結(jié)果并不一致。形成16條單價體的原因可能為同源染色體沒有發(fā)生聯(lián)會，二價體提早分離；或許是不規(guī)則聯(lián)會，即幾條染色體（并非兩同源染色體）不規(guī)則地聯(lián)在一起等造成的。在試驗中發(fā)現(xiàn)，形成的單價體能正常分離，因此認為東北蒲公英形成單價體的主要原因是同源染色體沒有發(fā)生聯(lián)會造成的。正因為如此，所以在后期可能出現(xiàn)不正常的分離，從而影響東北蒲公英花粉的育性。Khazanehdari等[16]也發(fā)現(xiàn)減數(shù)分裂中期單價體會引起后期的不均等分離，從而降低花粉育性。根據(jù)我們對離體花粉萌發(fā)的研究，東北蒲公英的花粉活性在60%左右，這也佐證了東北蒲公英的花粉發(fā)育存在一些異常的情況。

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