蕨菜組織培養(yǎng)的消毒方法比較

摘要：以蕨菜[Pteridium aquilinum （L.） Kuhn var. latiusculum（Desv.） Underw. ex Heller]粗壯、幼嫩的莖段為外植體實(shí)施組織培養(yǎng)，比較了不同的消毒步驟及洗刷處理對(duì)蕨菜莖段的消毒效果。結(jié)果表明，用柔軟毛筆對(duì)蕨菜莖段表面洗刷1 min，再用75%的乙醇浸泡15 s，接著用1.0 g/L的HgCl2溶液處理5 min，取得了組織培養(yǎng)最佳的消毒效果，其污染率為15.0%，成活率達(dá)66.7%，是試驗(yàn)范圍內(nèi)效果最佳的消毒方法。

關(guān)鍵詞：蕨菜[Pteridium aquilinum （L.） Kuhn var. latiusculum（Desv.） Underw. ex Heller]；組織培養(yǎng)；外植體；消毒

中圖分類號(hào)：S647；Q943.1；Q94-336 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）16-3852-04

蕨菜[Pteridium aquilinum（L.）Kuhn var. latiusculum（Desv.）Underw. ex Heller]屬鳳尾蕨科（Pteridaceae）蕨屬（Pteridium Gled.ex Scop）多年生草本植物，又名如意菜、龍頭菜、拳頭菜、貓爪子菜等[1]。作為蔬菜食用，其營(yíng)養(yǎng)豐富、質(zhì)脆、味鮮，具有特別的清香味。研究分析表明，蕨菜嫩葉的營(yíng)養(yǎng)成分齊全且含量高，每100 g可食部分含水分86.0 g、蛋白質(zhì)1.6 g、脂肪0.4 g、糖類10.0 g、粗纖維1.3 g、鈣2.4 mg、磷29.0 mg、鐵6.7 mg，尤其是蕨菜內(nèi)含有17種氨基酸，其中人體必需的賴氨酸（Lysine）、色氨酸（Tryptophane）、苯丙氨酸（Phenylalanine）、蛋氨酸（Methionine）、蘇氨酸（Threonine）、異亮氨酸（Isoleucine）、亮氨酸（Leucine）、纈氨酸（Viline）8種氨基酸除色氨酸外都含有一定的比例，它們占了蕨菜氨基酸總含量的39.4%[2，3]。另外，在藥理方面，蕨菜的根莖或全草可入藥，具有較高的藥用價(jià)值；從中醫(yī)藥角度來(lái)看，蕨菜味甘性寒，具清熱化痰、降氣潤(rùn)腸、活血化淤、安神利尿之功效，經(jīng)常食用對(duì)軟化血管、降低膽固醇含量、預(yù)防類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎與心臟病及癌癥均有療效[3，4]。由于蕨菜的高營(yíng)養(yǎng)、高醫(yī)療保健作用和回歸自然、無(wú)公害等高品質(zhì)的不斷發(fā)掘，使其成為都市人渴望“回歸自然”的“野味食品”[5，6]。特別是近幾年來(lái)蕨菜大量地出口日本、韓國(guó)、新西蘭等發(fā)達(dá)國(guó)家，造成價(jià)格持續(xù)上升，進(jìn)而成為山丘地帶農(nóng)民脫貧致富的新門路[7]?，F(xiàn)在的蕨菜市場(chǎng)呈供不應(yīng)求的局面，隨之而來(lái)的是人們對(duì)野生蕨類植物的過(guò)度采摘，這嚴(yán)重影響了其資源的可持續(xù)利用，導(dǎo)致產(chǎn)量逐年減少[8]。為滿足人們對(duì)食用蕨菜的需求，對(duì)野生蕨菜實(shí)行人工繁殖已經(jīng)刻不容緩。目前在蕨菜種植方面，國(guó)內(nèi)大多采用蕨菜根莖進(jìn)行無(wú)性繁殖，但其繁殖系數(shù)低、不便運(yùn)輸；也有采用孢子實(shí)施有性繁殖，但因季節(jié)的影響使孢子采集不易。上述問(wèn)題利用植物組織培養(yǎng)方法生產(chǎn)再生植株可以解決[9，10]；但是在植物組織培養(yǎng)實(shí)際操作中，以野生蕨菜的莖段作為外植體時(shí)出現(xiàn)的污染率很高，并成為組織培養(yǎng)成功與否的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。為此試驗(yàn)采用不同消毒步驟和洗刷方式對(duì)蕨菜莖段進(jìn)行了外植體成活率的影響研究，探索蕨菜外植體的消毒規(guī)程，以期為蕨菜人工組織培養(yǎng)快速繁育技術(shù)的制訂提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料為蕨菜的幼嫩莖段，采于廣西壯族自治區(qū)百色市郊外的麒麟山山麓。采集時(shí)選擇粗壯、第一片葉還未長(zhǎng)出的幼莖，取幼莖頂點(diǎn)以下10 cm左右較易折斷、無(wú)維管絲相連的莖段。

試劑有乙醇、HgCl2、KNO3、NH4NO3、KH2PO4、MgSO4·7H2O、CaCl2·2H2O、KI、H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O、Na2-EDTA、FeSO4·7H2O、肌醇、甘氨酸、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇、煙酸；所有試劑都為分析純。

儀器主要是百色學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室已有的人工氣候培養(yǎng)箱、無(wú)菌接種工作臺(tái)、高壓滅菌釜、電子天平、手術(shù)刀等，以及三角瓶、試管、燒杯、量筒、吸管、試管刷、毛筆等試驗(yàn)器皿及用品。

1.2 方法

1.2.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基配制 蕨菜組織培養(yǎng)采用的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基+蔗糖30 g/L+瓊脂7 g/L，1/2MS培養(yǎng)基的組成為：①大量元素，KNO3 950 mg/L、NH4NO3 825 mg/L、KH2PO4 85 mg/L、MgSO4·7H2O 185 mg/L、CaCl2·2H2O 220 mg/L；②微量元素，KI 0.83 mg/L、H3BO3 6.20 mg/L、MnSO4·4H2O 22.30 mg/L、ZnSO4·7H2O 8.60 mg/L、Na2MoO4·2 H2O 0.25 mg/L、CuSO4·5H2O 0.03 mg/L、CoCl2·6H2O 0.03 mg/L、Na2-EDTA 37.30 mg/L、FeSO4·7H2O 27.80 mg/L；③其他有機(jī)營(yíng)養(yǎng)成分，肌醇100.0 mg/L、甘氨酸2.0 mg/L、鹽酸硫胺素0.1 mg/L、鹽酸吡哆醇0.5 mg/L、煙酸0.5 mg/L；培養(yǎng)基pH調(diào)為5.6～5.8。

1.2.2 外植體的預(yù)處理 將采集回來(lái)的蕨菜樣品選擇粗壯、幼嫩的莖段，把較細(xì)的莖端和較老的部分切除，隨后將篩選好的外植體放入大燒杯中用自來(lái)水浸洗5 min（可用清潔洗滌劑），再用流水沖洗10 min，盛入合適的燒杯中，晾干后帶入無(wú)菌接種室備用。

1.2.3 表面消毒試驗(yàn) 在接種室將蕨菜外植體先用75%乙醇浸泡15 s，再迅速用無(wú)菌的去離子水浸洗3 min；然后分別用0.5、1.0、2.0 g/L的HgCl2溶液浸泡5 min或8 min，構(gòu)成6個(gè)處理，處理1為HgCl2溶液濃度0.5g/L、消毒時(shí)間5 min；處理2為HgCl2溶液濃度0.5g/L、消毒時(shí)間8 min；處理3為HgCl2溶液濃度1.0 g/L、消毒時(shí)間5 min；處理4為HgCl2溶液濃度1.0 g/L、消毒時(shí)間8 min；處理5為HgCl2溶液濃度2.0 g/L、消毒時(shí)間5 min；處理6為HgCl2溶液濃度2.0 g/L、消毒時(shí)間8 min。各處理再用無(wú)菌的去離子水浸洗3次，每次3 min，做HgCl2濃度和處理時(shí)間的消毒篩選試驗(yàn)。將表面消毒處理后的蕨菜外植體接種到配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理接種60瓶，共接種360瓶，并將接種好的培養(yǎng)瓶置于溫度25 ℃、空氣相對(duì)濕度70%、光照度2 000 lx、光照時(shí)間13 h/d的人工氣候培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)20 d后統(tǒng)計(jì)已污染的外植體，計(jì)算污染率[11，12]，污染率=（污染外植體瓶數(shù)/接種外植體總瓶數(shù)）× 100%。將未污染的外植體取出，用手術(shù)刀將其解剖開(kāi)，觀察莖內(nèi)部的壞死情況，將有綠色存活的外植體視為成活，計(jì)算成活率，成活率=（未污染且發(fā)生萌動(dòng)的瓶數(shù)/ 接種外植體總瓶數(shù)）× 100%。

1.2.4 洗刷處理試驗(yàn) 將預(yù)處理后的蕨菜外植體分成3個(gè)處理。處理7不做洗刷處理，只是浸泡，作為對(duì)照（CK）；處理8用柔軟毛筆對(duì)每根蕨菜莖段表面洗刷1 min；處理9用試管刷對(duì)每根蕨菜莖段表面洗刷1 min。再將3個(gè)處理蕨菜莖段帶入無(wú)菌接種室，先用75 %乙醇浸泡15 s，迅速用無(wú)菌的去離子水浸洗3 min；然后用1.0 g/L的HgCl2浸泡5 min，再用無(wú)菌的去離子水浸洗3次，每次3 min。將洗刷處理后的3組蕨菜外植體接種到配制好的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，每處理接種60瓶，共接種180瓶，并將接種好的培養(yǎng)瓶置于溫度25 ℃、空氣相對(duì)濕度70%、光照度2 000 lx、光照時(shí)間13 h/d的人工氣候培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計(jì)已污染的外植體，計(jì)算污染率；將未污染的外植體取出，用手術(shù)刀將其剖開(kāi)，觀察莖內(nèi)部的壞死情況，將有綠色存活的外植體視為成活，計(jì)算成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 表面消毒方法對(duì)蕨菜組織培養(yǎng)外植體成活率和污染率的影響

經(jīng)過(guò)20 d的組織培養(yǎng)后，不同的HgCl2溶液濃度與消毒時(shí)間處理對(duì)蕨菜外植體的成活率和污染率影響結(jié)果見(jiàn)表1和圖1。由表1和圖1可以看出，蕨菜外植體在先用75%乙醇處理15 s、再用HgCl2消毒5 min的前提下，隨著HgCl2溶液濃度的遞增，污染瓶數(shù)、污染率呈降低的變化趨勢(shì)，其成活瓶數(shù)、成活率先增加后減少，在HgCl2溶液濃度為1.0 g/L時(shí)達(dá)最大值（63.3%）；而當(dāng)HgCl2溶液消毒時(shí)間為8 min時(shí)，隨著HgCl2溶液濃度的遞增，污染瓶數(shù)、污染率、成活瓶數(shù)、成活率均呈下降的變化趨勢(shì)；在同一HgCl2溶液濃度下，隨著消毒時(shí)間的延長(zhǎng)，污染瓶數(shù)、污染率、成活瓶數(shù)、成活率也呈下降的變化趨勢(shì)。由此可見(jiàn)，高濃度、長(zhǎng)時(shí)間的HgCl2溶液處理能夠有效降低蕨菜莖段在組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染程度，但同時(shí)也降低了蕨菜莖段的成活率；因此在綜合比較后，確定試驗(yàn)中HgCl2溶液濃度為1.0 g/L、消毒5 min的處理是蕨菜莖段組織培養(yǎng)最佳的消毒方法。

2.2 洗刷處理方式對(duì)蕨菜組織培養(yǎng)外植體成活率和污染率的影響

經(jīng)過(guò)20 d的組織培養(yǎng)后，不同的洗刷處理方式對(duì)蕨菜外植體成活率和污染率的影響結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)表2可以看出，經(jīng)過(guò)毛筆和試管刷洗刷后的蕨菜莖段在組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染瓶數(shù)和污染率都比對(duì)照降低，以試管刷洗刷的處理污染率最低，僅為11.7%，比對(duì)照20.0%的污染率降低了8.3個(gè)百分點(diǎn)，比毛筆洗刷處理后15.0%的污染率降低了3.3個(gè)百分點(diǎn)。但在成活瓶數(shù)和成活率方面，經(jīng)毛筆洗刷后的處理成活率最高，達(dá)到了66.7%，比對(duì)照的63.3%成活率提高了3.4個(gè)百分點(diǎn)；而經(jīng)過(guò)試管刷洗刷的處理卻降低了成活率，僅為51.7%，比對(duì)照還降低了11.6個(gè)百分點(diǎn)，比毛筆洗刷處理更是降低了15.0個(gè)百分點(diǎn)。綜合比較后認(rèn)為，用毛筆洗刷外植體是較合適的蕨菜莖段組織培養(yǎng)洗刷處理方式，其能減少蕨菜莖段在組織培養(yǎng)過(guò)程中的污染數(shù)和污染率，并提高了成活率。

3 小結(jié)與討論

外植體消毒是組織培養(yǎng)技術(shù)的第一步基礎(chǔ)工作，也是最重要的步驟；消毒不徹底將嚴(yán)重影響組織培養(yǎng)過(guò)程中愈傷組織的誘導(dǎo)[13]。在試驗(yàn)過(guò)程中，蕨菜莖段接種幾天后外植體表面就出現(xiàn)了褐化現(xiàn)象，不過(guò)莖段上的凹痕卻能長(zhǎng)時(shí)間保持綠色，只有一部分在培養(yǎng)10 d左右后逐漸全段褐化。這些全段褐化的外植體大多為較細(xì)的莖段和莖段頂端極幼嫩的部分。培養(yǎng)的第一周，污染主要是由真菌造成的；第二周的污染數(shù)減少，污染主要是由細(xì)菌造成的。通過(guò)20 d的培養(yǎng)后取出外植體，用手術(shù)刀從凹痕處切開(kāi)，結(jié)果顯示凹痕還顯綠色的外植體其內(nèi)部依然保持著鮮活狀態(tài)，水分含量也變化不大；而凹痕已經(jīng)全段褐化的外植體一部分內(nèi)部有鮮活組織存在，但是活組織的分布向莖段中心縮減，甚至一些活組織變成黃綠色，另一部分外植體的內(nèi)部基本無(wú)綠色組織存在，試驗(yàn)將這些無(wú)綠色組織的外植體視為死亡。如處理3在用75%乙醇消毒15 s后，接著用1.0 g/L 的HgCl2溶液消毒5 min，則消毒效果較佳，此處理的污染率為20.0%，成活率達(dá)63.3%；還有大約16.7%（10瓶）的蕨菜莖段未污染，但也未能成活；這可能是由于75%乙醇的穿透能力較強(qiáng)，加之HgCl2的強(qiáng)滅活能力，造成這部分蕨菜莖段的死亡。

由于蕨菜生長(zhǎng)在野外環(huán)境里，處在微生物的包圍中，加上蕨菜莖段表面生有細(xì)毛，為試驗(yàn)的清洗和表面消毒帶來(lái)了不便。通過(guò)對(duì)蕨菜莖段表面進(jìn)行洗刷，能夠有效地實(shí)施表面消毒，降低污染率。然而洗刷不當(dāng)會(huì)傷害外植體的表皮，使75%乙醇、HgCl2更容易進(jìn)入體內(nèi)而破壞內(nèi)部組織，從而引發(fā)外植體死亡。試驗(yàn)用柔軟毛筆洗刷，則基本不會(huì)傷害外植體的表皮，能有效地完成表面消毒，達(dá)到一定的試驗(yàn)消毒效果，使蕨菜莖段的污染率比不洗刷的對(duì)照降低了5.0個(gè)百分點(diǎn)，成活率也比對(duì)照有所提高。而試管刷洗刷的處理由于刷上的毛較硬，容易刷傷外植體表皮，雖然該處理污染率最低，僅為11.7%，但成活率只有51.7%，比毛筆洗刷處理的66.7%成活率下降了15.0個(gè)百分點(diǎn)。

綜合污染率和成活率來(lái)考慮，蕨菜莖段在組織培養(yǎng)中用柔軟毛筆對(duì)每根蕨菜莖段表面洗刷1 min，再用75%乙醇消毒15 s，接著用1.0 g/L HgCl2溶液消毒5 min，則污染率為15.0%，成活率達(dá)66.7%，消毒效果在試驗(yàn)范圍內(nèi)達(dá)到了最佳。

參考文獻(xiàn)：

[1] 王正華，趙 梅，楊 華，等.野生蕨菜的馴化栽培及加工[J]. 加工與貯藏，2006（2）：40-41.

[2] 王新華，趙恒田，盛慶軍.蕨類山野菜人工繁殖及其研究進(jìn)展[J].北方園藝，2004（6）：4-6.

[3] 馬 博，蘇仕林，李榮峰.蕨菜化學(xué)成分及其生物活性研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2011，32（3）：413-416.

[4] 李榮峰，蘇仕林，馬 博.野生蕨菜的采后生理變化及保鮮技術(shù)研究[J].百色學(xué)院學(xué)報(bào)， 2010，23（6）：90-93.

[5] 趙守訓(xùn)，秦 康，丁志遵，等.中藥辭海（第三卷）[M]. 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，1997.1443.

[6] 劉艷霞，馬衛(wèi)東.蕨菜及其栽培技術(shù)[J]. 河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2001（6）：39-41.

[7] 方利娟，蘇仕林. 蕨菜的價(jià)值及其開(kāi)發(fā)利用[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2005（15）：124-127.

[8] DOUGLAS G E. A new technique for the culture of fern gametophytes[J]. Plant Cell Reports，1990，8（10）：632-634.

[9] 馬 博，李榮峰，潘治成.蕨菜快速繁殖研究[J].百色學(xué)院學(xué)報(bào)，2010，23（3）：90-93.

[10] 方利娟，蘇仕林，李榮峰. 蕨菜的人工繁殖技術(shù)初報(bào)[J].農(nóng)技服務(wù)，2010，27（2）：207-208.

[11] 賴玉潔，路丙社，陳書明，等.青榨槭外植體消毒方法初步研究[J]. 河北林果研究，2007，22（2）：143-145，158.

[12] 肖顯華，王順珍，藏林榮，等.植物材料表面消毒方法的改進(jìn)[J].生物技術(shù)，1999，9（1）：43-45.

[13] 王利民，周 毅，陳龍友，等.植物組織培養(yǎng)中消毒劑的運(yùn)用[J].貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，20（1）：15-17.