龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓DNA損傷的研究

摘要：利用龍鳳濕地不同濃度梯度（100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%）的水樣培養(yǎng)霍夫水絲蚓（Limnodrilus hoffmeisteri），通過單細(xì)胞凝膠電泳試驗檢測霍夫水絲蚓細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷情況，研究龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓的遺傳毒性效應(yīng)。結(jié)果表明，隨著水樣濃度的增加，霍夫水絲蚓DNA損傷也加大，龍鳳濕地水體具有遺傳毒性，需要重視對龍鳳濕地水質(zhì)的監(jiān)測和治理工作。

關(guān)鍵詞：龍鳳濕地；霍夫水絲蚓（Limnodrilus hoffmeisteri）；單細(xì)胞凝膠電泳；DNA損傷

中圖分類號：X832 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3436-03

大慶市龍鳳濕地自然保護(hù)區(qū)位于大慶市龍鳳區(qū)東南，東經(jīng)125°07′-125°15′，北緯46°28′-46°32′，距市中心僅8 km，由烏裕爾河下游流域永久性及季節(jié)性淡水沼澤地和小型潛水湖組成。自然保護(hù)面積約為5 996 hm2，核心面積為3 085.07 hm2，緩沖區(qū)面積為609.56 hm2。龍鳳濕地是鳥類重要的繁殖地和遷徙的中繼站，有野生動物207種，其中鳥類有76 種，有丹頂鶴、東方白鸛、大鴇等5種國家一級保護(hù)鳥類；有大天鵝、灰鶴、鴛鴦等19種國家二級保護(hù)鳥類；有大白鷺、青頭潛鴨等19種省級重點保護(hù)鳥類。另外，龍鳳濕地還有魚類45種，維管束植物314種[1]。龍鳳濕地是大慶油田和石油化工的滯洪區(qū)，在發(fā)揮防洪、滯洪功能的同時，還起著調(diào)節(jié)城市的小氣候、增加空氣溫度、滯留與降解自然來水中的有害物質(zhì)、美化環(huán)境、豐富市民生活的作用。

1984年，Ostling首創(chuàng)了單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)（Single cell gel electrophoresis，SCGE），隨后Singh將方法加以完善，形成一種快速檢測單細(xì)胞DNA損傷的方法[2]。單細(xì)胞凝膠電泳通過對培養(yǎng)動物的細(xì)胞懸液進(jìn)行電泳，從而檢測其DNA損傷，具有靈敏度高、迅速、簡便、經(jīng)濟(jì)以及所需細(xì)胞少等優(yōu)點。近年來，單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境毒理學(xué)檢測、細(xì)胞凋亡研究、疾病的預(yù)防與檢測等領(lǐng)域[3]?；舴蛩z蚓（Limnodrilus hoffmeisteri）屬環(huán)節(jié)動物門寡毛綱近孔目顫蚓科水絲蚓屬，生活于污染較重的水域，如含有機質(zhì)、腐殖質(zhì)較多的污水溝、排水口等處?；舴蛩z蚓對環(huán)境條件的變化特別敏感，常被作為環(huán)境監(jiān)測的指示動物[4]。本研究利用龍鳳濕地不同濃度梯度（100%﹑95%﹑90%﹑85%﹑80%）的水樣培養(yǎng)霍夫水絲蚓，通過單細(xì)胞凝膠電泳試驗檢測霍夫水絲蚓細(xì)胞內(nèi)DNA的損傷情況，研究龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓的遺傳毒性效應(yīng)，進(jìn)而對龍鳳濕地水體毒性進(jìn)行監(jiān)測，為龍鳳濕地水污染防治和環(huán)境保護(hù)提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 霍夫水絲蚓購自大慶市讓胡路農(nóng)貿(mào)花鳥魚市場。

1.1.2 儀器 Nikon 80i型熒光顯微鏡、DYY-6C+DYCE-27型電泳儀、DF-101S型集熱加熱式磁力攪拌器、TGL-16M型高速臺式冷凍離心機、Eppendorf微量移液器等。

1.2 方法

1.2.1 水樣的處理 按照《中華人民共和國國家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)》中關(guān)于天然水樣采集規(guī)定操作[5]。選擇3個樣點，分別標(biāo)示為A、B、C樣點。用采樣桶每月采樣一次。采回的水樣于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 霍夫水絲蚓的培養(yǎng) 在15～18 ℃條件下將霍夫水絲蚓培養(yǎng)于大培養(yǎng)皿中，每天清洗一次，2～3 d后選取長度相對一致的霍夫水絲蚓為試驗動物。分別設(shè)試驗組和對照組，EMS培養(yǎng)液作為陽性對照，蒸餾水作為陰性對照。

1.2.3 急性毒性試驗 將水樣用8層紗布過濾，用蒸餾水將過濾后的水樣配制成質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為80%、85%、90%、95%、100%的水樣培養(yǎng)液，各取50 mL倒入培養(yǎng)皿中。每組各隨機加入長度相近的霍夫水絲蚓30條，培養(yǎng)3 h，溫度控制在20～22 ℃。霍夫水絲蚓中毒后死亡的癥狀主要表現(xiàn)為身體泛白、失去伸縮能力、用解剖針碰觸完全無反應(yīng)則為死亡[6]。

1.2.4 單細(xì)胞凝膠電泳試驗

1）單細(xì)胞懸液的制備。將染毒恢復(fù)后的霍夫水絲蚓取出，吸干水分，放入裝有緩沖液的研缽中充分研磨。將研磨液用200目尼龍網(wǎng)過濾、離心，吸取上清液。反復(fù)沖洗離心，取上清液。濾液即為霍夫水絲蚓單細(xì)胞懸液。

2）DNA損傷測試。按照《現(xiàn)代環(huán)境生物學(xué)實驗技術(shù)與方法》中單細(xì)胞凝膠電泳技術(shù)操作[7]。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析 選擇有代表性的20個拖尾細(xì)胞，切換到圖像分析軟件窗口進(jìn)行彗星測量、分析[8]。使用SPSS 10.0軟件和CASP軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 A樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷

從圖1可以看出，當(dāng)龍鳳濕地A樣點水樣稀釋為80%～85%濃度時，DNA損傷程度比較小，而當(dāng)濃度達(dá)85%以上時曲線斜度急速增大，表明霍夫水絲蚓DNA損傷加大。

2.2 B樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷

由圖2可知，當(dāng)龍鳳濕地B樣點水樣稀釋為80%～85%濃度時，DNA損傷程度比較小，而當(dāng)濃度達(dá)90%以上時，曲線斜度急速增大，說明DNA損傷加大，其原因可能是污水濃度太大，嚴(yán)重影響霍夫水絲蚓DNA的復(fù)制，使DNA變異，產(chǎn)生嚴(yán)重的損傷。

2.3 C樣點水樣對霍夫水絲蚓DNA的損傷

從圖3可以看出，當(dāng)龍鳳濕地C樣點水樣濃度在80%以上時，DNA損傷急劇上升，且DNA損傷程度較A樣點嚴(yán)重，這是由于C樣點更靠近東城區(qū)污水處理廠的排水渠，而A樣點則是在龍鳳濕地的中心地帶，兩個采樣點的水體受污染程序有較大差別。

3 小結(jié)與討論

龍鳳濕地水體對霍夫水絲蚓DNA有損傷，但在短時間內(nèi)不足以致使霍夫水絲蚓死亡，說明城市污水經(jīng)處理后流入龍鳳濕地對霍夫水絲蚓短時間內(nèi)的影響不大，其原因可能是龍鳳濕地水體面積太大，使有毒物質(zhì)稀釋；還有可能是排放入龍鳳濕地水體有毒物質(zhì)含量較少，污水處理企業(yè)處理污水達(dá)到正常標(biāo)準(zhǔn)。隨著水樣濃度的增加，水中能造成DNA損傷的物質(zhì)濃度也增大，致使霍夫水絲蚓DNA受到的損傷越重。

參考文獻(xiàn)：

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