甘藍(lán)型油菜MYB4基因反義植物表達(dá)載體的構(gòu)建

摘要：將甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）MYB4基因家族共保守的467 bp反義片段構(gòu)建到中間載體pCambia2301G中，替換GUS基因，由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，形成了反義植物表達(dá)載體，命名為pCambia2301G-MYB4A， 并轉(zhuǎn)化到根癌農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）LBA4404中形成工程菌株，為進(jìn)一步研究甘藍(lán)型油菜MYB4基因家族的功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）；苯丙烷代謝途徑；MYB4基因

中圖分類號(hào)：S565.4；Q943.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）14-3428-03

甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.）是重要的油料作物之一。甘藍(lán)型油菜中與苯丙烷代謝途徑相關(guān)的農(nóng)藝性狀是研究人員長(zhǎng)期致力于遺傳改良的焦點(diǎn)。經(jīng)常發(fā)生的倒伏問(wèn)題要求更加強(qiáng)壯的莖和分枝，抗病性的提高要求更高水平的受病原菌入侵而誘導(dǎo)的細(xì)胞壁木質(zhì)化[1-3]。另外，油菜種皮柵狀細(xì)胞層中的色素主要與種皮中類黃酮類物質(zhì)緊密相關(guān)，種皮中類黃酮類物質(zhì)積累越多，種皮的顏色就越深，積累越少或沒(méi)有時(shí)種皮就呈黃色，即呈現(xiàn)種胚的顏色，從而表現(xiàn)出黃子性狀的優(yōu)質(zhì)特性[4，5]。

AtMYB4屬于擬南芥R2R3-MYB家族的一種新的負(fù)調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，對(duì)于植株中抗紫外線類的芥子酸酯類物質(zhì)的合成具有重要調(diào)控作用，該基因在大多數(shù)的植物組織中均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)擬南芥AtMYB4基因突變體葉片中芥子酸酯的含量升高，并呈現(xiàn)出比野生型更強(qiáng)的紫外線耐受能力。已報(bào)道AtMYB4轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控苯丙烷代謝途徑關(guān)鍵酶基因C4H的表達(dá)[6-8]。因此，研究MYB4基因有利于闡明甘藍(lán)型油菜苯丙烷類物質(zhì)合成和相關(guān)性狀形成的分子機(jī)理。本研究通過(guò)構(gòu)建甘藍(lán)型油菜MYB4基因反義植物表達(dá)載體，為研究MYB4基因家族功能，闡明油菜木質(zhì)素、種皮色素、花青素、植保素、芥子酸等成分的生物合成機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種及質(zhì)粒 E. coli DH5α、根癌農(nóng)桿菌（A. tumefaciens）LBA4404、植物表達(dá)中間載體pCambia2301G均由重慶市油菜工程技術(shù)研究中心保存；pMD18-T載體購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.2 試劑 Taq DNA聚合酶、胰蛋白胨、酵母浸出物、氨芐青霉素（Amp）、卡那霉素（Kan）、利福平（Rif）、鏈霉素（Str）購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司；dNTPs、瓊脂糖、λ DNA/HindⅢ DNA Marker、DL2000 DNA Marker及DNA Ligation Kit均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；限制性內(nèi)切酶購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒購(gòu)自上海華舜生物工程公司；質(zhì)粒提?。ㄐ×浚┰噭┖匈?gòu)自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 反義片段的克隆 對(duì)本課題組已克隆的甘藍(lán)型油菜MYB4基因家族（MYB4-1至MYB4-4，詳細(xì)結(jié)果待發(fā)表）各成員全長(zhǎng)序列進(jìn)行多重比對(duì)，根據(jù)該基因家族特異的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物：FMYB4A（5′-GAGCTCAGAATCAGCCTTCCTGAT-3′）和RMYB4A（5′-GGATCCTCTAGAGATTCGCTACGT-3′），上、下游引物的5′端分別引入了SacⅠ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)。以甘藍(lán)型油菜基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性1 min，63 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，回收后與pMD18-T載體連接并測(cè)序。

1.2.2 pCambia2301G-MYB4A重組質(zhì)粒的構(gòu)建 采用質(zhì)粒抽提試劑盒提取pMD18-T-MYB4A質(zhì)粒，分別用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pMD18-T-MYB4A質(zhì)粒和植物表達(dá)中間載體pCambia2301G。采用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并利用膠回收試劑盒回收目標(biāo)片段。將回收的目標(biāo)片段用T4 DNA連接酶16 ℃連接4 h后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，并用BamHⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定。

1.2.3 pCambia2301G-MYB4A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌 根癌農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞的制備參照文獻(xiàn)[9]，將5 μL重組質(zhì)粒采用液氮冷激法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404，涂布于含有100 mg/L Kan、40 mg/L Rif、20 mg/L Str的LB平板，28 ℃倒置培養(yǎng)2 d，挑取菌落接種于含相同抗生素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，菌液提取質(zhì)粒BamHⅠ/SacⅠ雙酶切鑒定，將陽(yáng)性菌保存于-80 ℃。

2 結(jié)果與分析

2.1 反義片段的克隆

以FMYB4A/RMYB4A引物、基因組DNA模板，PCR擴(kuò)增反義片段后，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后出現(xiàn)了1條與預(yù)期大小相符的目的片段（圖1），回收該目的片段后連接pMD18-T載體轉(zhuǎn)化DH5α，挑選單菌落測(cè)序驗(yàn)證。

2.2 反義表達(dá)植物載體的構(gòu)建與鑒定

BamHⅠ/SacⅠ雙酶切pMD18-T-MYB4A，酶切后產(chǎn)生467 bp的MYB4A目的片段和約2.7 kb的pMD18-T載體骨架條帶（圖2）。對(duì)pCambia2301G質(zhì)粒同樣進(jìn)行BamHⅠ/SacⅠ雙酶切，切去1.9 kb的GUS基因后回收約12 kb的pCambia2301G載體骨架，然后將其與MYB4A目的片段進(jìn)行連接，得到重組質(zhì)粒pCambia2301G-MYB4A。pCambia2301G-MYB4A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α，用BamHⅠ/SacⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定（圖3）。結(jié)果表明，反義片段MYB4A已定向克隆到中間載體pCambia2301G中，成功替換其中的GUS基因，形成了反義植物表達(dá)載體pCambia2301G-MYB4A，反義片段MYB4A由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，后接Nos終止子，形成表達(dá)盒。

2.3 pCambia2301G-MYB4A重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌

將構(gòu)建好的植物表達(dá)載體的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌LBA4404的感受態(tài)后，得到抗Kan+Rif+Str的陽(yáng)性克隆，參照大腸桿菌克隆子同樣的方法進(jìn)行雙酶切（圖4）。結(jié)果表明，目的片段成功轉(zhuǎn)化進(jìn)了根癌農(nóng)桿菌，得到了pCambia2301G-MYB4A工程菌株。

3 小結(jié)與討論

苯丙烷代謝途徑中，相關(guān)酶基因的啟動(dòng)序列上都含有一些高度保守的順式作用元件，為某些轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。因此，可通過(guò)調(diào)節(jié)木質(zhì)素的合成控制轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來(lái)抑制多個(gè)基因的表達(dá)。近來(lái)通過(guò)對(duì)木質(zhì)素合成相關(guān)酶基因的啟動(dòng)子序列分析發(fā)現(xiàn)，在PAL、4CL、CAD等基因的啟動(dòng)子序列上都具有一個(gè)PAL盒元件，該元件與苯丙氨酸基因的表達(dá)調(diào)控有關(guān)，如MYB和Ntlim1轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點(diǎn)。Tamagnone等[10]、Kawaoka等[11]將這些調(diào)控苯丙酸及木質(zhì)素合成代謝的轉(zhuǎn)錄因子基因MYB和Ntlim1正向或反向?qū)胫参镏?，能同時(shí)調(diào)節(jié)多個(gè)相關(guān)酶的表達(dá)活性，致使植物木質(zhì)素合成受阻，木質(zhì)素含量下降。本研究通過(guò)對(duì)本課題組克隆的甘藍(lán)型油菜MYB4基因（MYB4-1至MYB4-4）進(jìn)行多序列比對(duì)分析，結(jié)合相關(guān)MYB類轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，避開MYB類轉(zhuǎn)錄因子共保守結(jié)構(gòu)域，根據(jù)MYB4家族蛋白C端高度保守結(jié)構(gòu)域，設(shè)計(jì)467 bp的反義片段，并構(gòu)建到中間載體pCambia2301G中，替換其中的GUS基因，由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)，形成了反義植物表達(dá)載體。該載體的成功構(gòu)建為揭示甘藍(lán)型油菜MYB4基因家族的功能、修飾油菜苯丙烷代謝途徑相關(guān)的性狀如芥子酸、木質(zhì)素、類黃酮等奠定了基礎(chǔ)。

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