酶聯(lián)免疫吸附法檢測飼料中赭曲霉毒素A

摘要：將赭曲霉毒素A進(jìn)行化學(xué)修飾，制備赭曲霉毒素A半抗原及人工抗原，免疫動物，并通過單克隆抗體技術(shù)制備了赭曲霉毒素A的單克隆抗體及酶標(biāo)記抗體，建立赭曲霉毒素A的酶聯(lián)免疫吸附法。結(jié)果表明，該法靈敏度為1 μg/L，在20 μg/kg和40 μg/kg的加標(biāo)水平下，赭曲霉毒素A在飼料（濃縮料、配合料和原料）的回收率為81.8%～96.1%，變異系數(shù)為8.3%～12.2%。本法適用于飼料樣本中赭曲霉毒素A的檢測。

關(guān)鍵詞：酶聯(lián)免疫吸附法；單克隆抗體；赭曲霉毒素A；飼料

中圖分類號：S816.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3406-03

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A）是一種真菌毒素，主要由產(chǎn)毒曲霉菌和青霉菌產(chǎn)生，常污染食品和飼料[1，2]。赭曲霉毒素A能引起動物急性和慢性中毒，是強(qiáng)致癌物，對腎臟造成不可逆的致死毒害，還可導(dǎo)致胎兒畸形、流產(chǎn)甚至死亡，其對人類的潛在危害備受關(guān)注[3，4]。國際癌癥研究機(jī)構(gòu)在1993年將其定為人類可能致癌物，赭曲霉毒素A廣泛存在于農(nóng)產(chǎn)品及畜產(chǎn)品中，通過污染食物和飼料直接或間接進(jìn)入人類食物鏈，因此有必要加強(qiáng)對赭曲霉毒素A的檢測[5，6]。

目前，赭曲霉毒素A的殘留分析方法主要有免疫學(xué)檢測方法和儀器分析方法，儀器檢測方法主要通過其熒光特性進(jìn)行高靈敏度檢測，其樣本處理過程一般較復(fù)雜，檢測成本較高；免疫分析法是以抗原抗體免疫化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)進(jìn)行測定的方法，具有靈敏度高、快速簡便等優(yōu)點(diǎn)[7，8]。本試驗(yàn)建立了基于單克隆抗體的ELISA法檢測赭曲霉毒素A，其靈敏度高、快速簡便，適用于飼料中赭曲霉毒素A的快速批量檢測。

1 材料與方法

1.1 樣品與主要試劑

飼料（濃縮料、配合料、原料）樣品購于貴陽某農(nóng)貿(mào)市場，均質(zhì)后置于4 ℃，待測。

赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品，購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）、辣根過氧化物酶（HRP），購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑，除特別注明外均購自北京化學(xué)試劑公司。

1.2 主要儀器

MK3酶標(biāo)儀（美國熱電雷勃儀器有限公司）；96孔酶標(biāo)板（美國Costar公司）；TDL-40B離心機(jī)（上海安亭）。

1.3 試驗(yàn)動物

8周齡雌性BalB/C小鼠，由北京勤邦生物技術(shù)有限公司提供并飼養(yǎng)。

1.4 方法

1.4.1 赭曲霉毒素A半抗原的合成 將赭曲霉毒素A與1， 3-丙二胺反應(yīng)得到赭曲霉毒素A半抗原。具體步驟如下：取20 mg赭曲霉毒素A，10 μL 1，3-丙二胺，催化量的4-二甲氨基吡啶溶解于2 mL N， N’-二甲基甲酰胺中，得到Ⅰ液；取20 mg N，N’-二環(huán)己基碳二亞胺溶解于0.5 mL DMF中，得到Ⅱ液；在0 ℃條件下，將Ⅱ液緩慢滴加至Ⅰ液中，恢復(fù)至室溫后，繼續(xù)反應(yīng)20 h；蒸除溶劑并柱層析（洗脫液：二氯甲烷/甲醇，體積比20∶1），得到赭曲霉毒素A半抗原。具體合成技術(shù)路線如圖1。

1.4.2 赭曲霉毒素A免疫原及包被原的合成 將赭曲霉毒素A半抗原分別與牛血清白蛋白（BSA）、卵清蛋白（OVA）偶聯(lián)，得到赭曲霉毒素A免疫原與包被原。免疫原合成過程：取赭曲霉毒素A半抗原5.3 mg用0.5 mL DMF溶解，得到Ⅰ液；取BSA 30 mg，以2.0 mL，pH 7.0，0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液溶解，得到Ⅱ液；取碳化二亞胺（EDC）10 mg，以0.5 mL，pH 7.0，0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液溶解，得到Ⅲ液；將Ⅰ液與Ⅱ液混合，在攪拌下緩慢滴加入Ⅲ液，室溫反應(yīng)2 h，4 ℃透析3 d，每天換液3次，得免疫原。包被原合成將載體蛋白換成OVA，制備過程參照免疫原制備過程。

1.4.3 動物免疫及單克隆抗體的制備 用150 μg的赭曲霉毒素A免疫原與等量完全福氏佐劑（FCA）混合制成乳化劑，頸背部皮下多點(diǎn)注射。二免和三免時(shí)，將FCA換成非完全福氏佐劑（FIA），劑量方法同上，每次免疫間隔時(shí)間為2周，三免后第7天，小鼠尾靜脈采血，室溫靜置1 h，4 ℃過夜，12 000 r/min離心10 min，收集血清，4 ℃保存，用間接ELISA法測定血清效價(jià)，待效價(jià)較高時(shí)，按照150 μg/只腹腔加強(qiáng)免疫。3 d后取小鼠脾臟進(jìn)行細(xì)胞融合，以有限稀釋法篩選陽性克隆，并按照常規(guī)方法制備腹水抗體，用飽和硫酸銨法純化后備用。

1.4.4 酶結(jié)合物的制備 采用過碘酸鈉法[9]制備抗體與辣根過氧化物酶（HRP）的酶標(biāo)記抗體。

1.4.5 包被 通過測定抗體效價(jià)，確定抗原、抗體的工作濃度，以此為基礎(chǔ)對酶標(biāo)板的包被工藝及各個(gè)環(huán)節(jié)的工作溫度、緩沖液體系進(jìn)行優(yōu)化[10，11]。制備檢測赭曲霉毒素A的酶標(biāo)板，用包被緩沖液將包被原稀釋成0.1～0.2 μg/mL，每孔加入100 μL，37 ℃溫育2 h，傾去包被液，用洗滌液洗滌2次，每次30 s，拍干，然后在每孔中加入150～200 μL封閉液，37 ℃溫育1～2 h，傾去孔內(nèi)液體拍干，干燥后用鋁膜真空密封保存，待用。

1.4.6 樣品分析 向包被有赭曲霉毒素A偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板微孔中加入赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品溶液或飼料樣品提取液20 μL，再加入酶結(jié)合物工作液100 μL，用蓋板模封板，25 ℃避光反應(yīng)10 min，倒出孔內(nèi)液體，每孔加入250 μL磷酸鹽緩沖液充分洗滌4～5次，每次間隔10 s，于吸水紙上拍干，每孔加入底物液A過氧化脲50 μL，底物液B四甲基聯(lián)苯胺（TMB）50 μL，輕輕振蕩混勻，25 ℃恒溫箱避光顯色5 min，每孔加入2 mol/L終止液硫酸50 μL，輕輕振蕩混勻，于450 nm下測定每孔吸光度值。

1.4.7 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線的制備 以不同濃度的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)液的吸光度平均值（B）除以空白溶液的吸光度值（B0）再乘以100%，得到競爭抑制率，以赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/L）的對數(shù)值（lgC）為X軸，競爭抑制率為Y軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.8 前處理 稱取5.0±0.05 g樣品至50 mL聚苯乙烯離心管中，加入25 mL 50%（V/V）甲醇，振蕩5 min，3 000 r/min離心5 min；取500 μL上清液于2 mL聚苯乙烯離心管中，加入500 μL 10%（m/V）氯化鈉水溶液，振蕩1 min，混勻；取20 μL分析。

1.4.9 最低檢測限、回收率及精密度 取20份空白樣品，按照上述步驟分析，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算對應(yīng)濃度。以20份空白樣品提取液的吸光值平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差作為樣本檢測的最低檢測限[12]；另取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品分別對飼料樣品按照20、40 μg/kg添加水平，進(jìn)行回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度做4個(gè)平行，計(jì)算準(zhǔn)確度及精密度。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線

從標(biāo)準(zhǔn)抑制曲線（表1、圖2）可得出，本方法檢測靈敏度為1 μg/L，赭曲霉毒素A單克隆抗體對赭曲霉毒素A的IC50值為5.3 μg/L。

2.2 最低檢測限

對空白飼料（濃縮料、配合料、原料）樣本平行測定20次，結(jié)果見表2。測定結(jié)果的平均值加上3倍標(biāo)準(zhǔn)差為試劑盒實(shí)際樣本的最低檢測限，結(jié)果表明本方法對濃縮料、配合料、原料的檢測限分別為9.3、9.0、8.2 μg/kg。

2.3 準(zhǔn)確度與精密度

ELISA法的準(zhǔn)確度以回收率表示，精密度以變異系數(shù)表示。取飼料樣本（濃縮料、配合料、原料）添加赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品至20、40 μg/kg，分別對樣本進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行，分別計(jì)算回收率與變異系數(shù)，結(jié)果見表3。

由表3可知，含20 μg/kg赭曲霉毒素A的濃縮料、配合料和原料的添加回收率為81.8%～94.5%，變異系數(shù)為10.3%～12.2%；含40 μg/kg赭曲霉毒素A的濃縮料、配合料和原料的添加回收率為84.8%～96.1%，變異系數(shù)為8.3%～10.9%。本試驗(yàn)結(jié)果符合農(nóng)醫(yī)發(fā)[2005]17號農(nóng)業(yè)部文件《獸藥殘留檢測試劑（盒）備案參考評判標(biāo)準(zhǔn)》，處于可接受范圍。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)制備了赭曲霉毒素A單克隆抗體，初步建立了赭曲霉毒素A酶聯(lián)免疫試劑盒檢測方法。結(jié)果表明，本方法的靈敏度為1 μg/L，對濃縮料、配合料和原料的檢測限分別為9.3、9.0和8.2 μg/kg，分別添加20、40 μg/kg水平赭曲霉毒素A，飼料（濃縮料、配合料和原料）的添加回收率為81.8%～96.1%，變異系數(shù)為8.3%～12.2%。運(yùn)用酶聯(lián)免疫方法對飼料中赭曲霉毒素A殘留量進(jìn)行篩選，樣本前處理簡單，儀器設(shè)備投資少，檢測成本低，所需檢測時(shí)間短，本方法適用于飼料樣本中赭曲霉毒素A的初篩。

參考文獻(xiàn)：

[1] 丁 平，侯亞莉，王永紅，等.赭曲霉毒素A的危害與防治[J].中國飼料，2010（17）：33-36.

[2] 丁建英，韓劍眾.赭曲霉毒素A的研究進(jìn)展[J].食品研究與開發(fā)，2006， 27（3）：112-115.

[3] 舒文祥，徐 煒，李 艷，等.膠體金免疫層析法快速檢測赭曲霉毒素 A 研究[J].糧食與油脂，2011，（10）：20-22.

[4] ABARCA M，BRAGULAT M， CASTELLA G， et al. Ochratoxin A production by strains of Aspergillus niger var. niger[J]. Applied Environmental Microbiology，1994，60（7）：2650-2652.

[5] 楊 琳，馬 良.免疫學(xué)法檢測赭曲霉毒素A研究進(jìn)展[J].糧食與油脂，2010（10）：33-35.

[6] 高璟瑜，楊 揚(yáng)，張紅星，等.抗赭曲霉毒A多克隆抗體的制備[J].現(xiàn)代食品科技，2011，27（3）：324-327.

[7] 褚慶華，郭德華，王 敏，等.谷物和酒類中赭曲霉毒素A的測定[J]. 中國國境衛(wèi)生檢疫雜志，2006，29（2）：109-112.

[8] GHALI R， HMAISSIA-KHLIFA K， GHORBEL H， et al. HPLC determination of ochratoxin A in high consumption Tunisian foods[J]. Food Control，2009，20（8）：716-720.

[9] 郭春祥，郭錫瓊.介紹一種簡單，快速，高效的辣根過氧化物酶標(biāo)記抗體的過碘酸鈉法[J]. 現(xiàn)代免疫學(xué)，1983（2）：54-57.

[10] 朱立平，陳學(xué)清.免疫學(xué)常用實(shí)驗(yàn)方法[M].北京：人民軍醫(yī)出版社，2000.

[11] 于秋香.對硫磷殘留的酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)的研究[D].北京：中國農(nóng)業(yè)大學(xué)，2003.

[12] DEGAND G， BERNES-DUYCKAERTS A， MAGHUIN-ROGISTER G. Determination of clenbuterol in bovine tissues and urine by enzyme immunoassay[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry，1992，40（1）：70-75.