葡萄子浸提液對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用

摘要：采用L16（45）正交試驗(yàn)浸提葡萄（Vitis vinifera）子中的活性成分，并測(cè)定了葡萄子浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除率以及對(duì)N-亞硝基化合物合成的阻斷率，進(jìn)而通過極差分析確定最佳浸提工藝條件。以對(duì)亞硝酸鈉的清除率為考察指標(biāo)，葡萄子活性成分的最佳浸提工藝條件為料液比1∶25（m/V，g∶mL），在沸騰回流條件下浸提2.0 h，該活性浸提液對(duì)亞硝酸鈉的最大清除率為90.2%。以對(duì)N-亞硝基化合物合成的阻斷率為考察指標(biāo)，葡萄子活性成分的最佳浸提工藝條件為料液比1∶25（m/V，g∶mL），在60 ℃下浸提2.0 h，該活性浸提液對(duì)N-亞硝基化合物合成的最大阻斷率為86.0%。

關(guān)鍵詞：葡萄（Vitis vinifera）子浸提液；阻斷；清除；亞硝酸鈉；N-亞硝基化合物

中圖分類號(hào)：O623.54；Q946；S663.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2013）14-3381-05

據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）統(tǒng)計(jì)，全球每年至少有500萬(wàn)癌癥患者，我國(guó)每年也約有60萬(wàn)～70萬(wàn)癌癥病人在經(jīng)歷著各種痛苦[1]。N-亞硝基化合物是國(guó)際上公認(rèn)的一類強(qiáng)致癌性化學(xué)物質(zhì)，包括亞硝胺和亞硝酰胺兩大類物質(zhì)，通常泛稱為亞硝胺，其生成的前體物質(zhì)是亞硝酸鹽和二級(jí)胺。在已研究的200多種N-亞硝基化合物中，約有80%以上對(duì)動(dòng)物有致癌性，如可誘發(fā)動(dòng)物的食道癌、胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、膀胱癌、肺癌等各種癌癥[2-4]。探究N-亞硝基化合物的致癌機(jī)理，可發(fā)現(xiàn)N-亞硝基化合物在一系列酶的作用下生成親電子的烷基自由基，正是這個(gè)烷基自由基使核酸烷化，引起細(xì)胞遺傳突變，從而顯示致癌性[5-7]。從防癌抗癌角度出發(fā)，采取阻斷N-亞硝基化合物的合成或清除合成N-亞硝基化合物的前體物質(zhì)的方法是防癌的有效措施。近年來(lái)的研究結(jié)果表明，很多天然植物浸提液都對(duì)N-亞硝基化合物的合成有一定抑制能力。如已報(bào)道的黃花菜[7]、蜜柚果皮[8]、石榴皮[9]、魚腥草[10]、鵝絨藤[11]、劉寄奴[12]等浸提液都具有一定的抑制N-亞硝基化合物形成的能力。葡萄子是葡萄屬（Vitis）植物葡萄（Vitis vinifera）的種子。研究表明，葡萄子中含量最豐富的是黃烷醇及其低聚物等黃酮類物質(zhì)，黃烷醇單體包括兒茶素、表兒茶素和表兒茶素沒食子酸酯。不同數(shù)量的黃烷醇單體聚合構(gòu)成原花青素。根據(jù)聚合度的不同，原花青素又分為低聚原花青素（Oligomeric proatho cyanidins，OPCs）和高聚原花青素（Polymeric proatho cyanidins，PPCs）[13]，并且對(duì)于葡萄子浸提液具有抗致突變與抗癌活性已有報(bào)道[14，15]。鑒于葡萄子浸提液在抗致突變與抗癌活性方面具有很好的生物活性，試驗(yàn)進(jìn)一步通過體外模擬人體胃液的條件，探討天然葡萄子浸提液抑制亞硝化反應(yīng)活性物質(zhì)的最佳浸提工藝條件，研究葡萄子浸提液清除亞硝酸鈉以及阻斷N-亞硝基化合物合成的效果，為葡萄子的合理利用提供一定的科學(xué)依據(jù)，同時(shí)為研究開發(fā)亞硝化反應(yīng)抑制劑提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料與試劑 葡萄購(gòu)于珠海市唐家市場(chǎng)。無(wú)水乙醇、檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液（自制）、亞硝酸鈉、二甲胺溶液、碳酸鈉、α-萘胺、對(duì)氨基苯磺酸、N-1-萘乙二胺鹽酸鹽、100～200目聚酰胺粉等試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備 UV752型紫外可見分光光度計(jì)購(gòu)自上海鳳凰光學(xué)科儀有限公司，ZF-I三用型紫外分析儀購(gòu)自上海顧村電光儀器廠，HWS24型電熱恒溫水浴鍋購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司，SHZ-D（III）型循環(huán)水式真空泵購(gòu)自鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司，JJ500型電子天平購(gòu)自常熟市雙杰測(cè)試儀器廠，PB-10型pH精密酸度計(jì)購(gòu)自賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司，EPED-T/D型實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器購(gòu)自南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司，F(xiàn)W80型高速萬(wàn)能粉碎機(jī)購(gòu)自天津泰斯特儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 浸提方法 將新鮮的葡萄去皮去果肉留子，用去離子水洗凈后自然晾干，用粉碎機(jī)粉碎，將粉末放置于干凈的燒杯中存于干燥器中備用。隨后按照一定的料液比加入一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，在特定溫度下浸提特定時(shí)間，冷卻至室溫后用聚酰胺粉過濾，得浸提液，密封保存于冰箱保鮮層備用。

1.2.2 單因素試驗(yàn) 以葡萄子研磨粉為試驗(yàn)材料，分別對(duì)水浴溫度、浸提時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比進(jìn)行單因素試驗(yàn)。以葡萄子浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除率作為考察指標(biāo)，所有試驗(yàn)均重復(fù)3次。①水浴溫度對(duì)清除率的影響。稱取葡萄子研磨粉1.000 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶25（m/V，g∶mL，下同）加入50%乙醇，分別以40、60、80 ℃水浴加熱2.0 h，過濾得浸提液，然后每次用移液管抽取浸提液2.5 mL置于25 mL比色管中，測(cè)定清除率。②浸提時(shí)間對(duì)清除率的影響。稱取葡萄子研磨粉1.000 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶25加入50%乙醇，以80 ℃水浴分別加熱1.0、1.5、2.0 h，過濾得浸提液，然后每次用移液管抽取浸提液2.5 mL置于25 mL比色管中，測(cè)定清除率。③乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)清除率的影響。稱取葡萄子研磨粉1.000 g于250 mL錐形瓶中，按料液比1∶25分別加入40%、60%、80%乙醇作浸提劑，以80℃水浴加熱2.0 h，過濾得浸提液，然后每次用移液管抽取提取液2.5 mL置于25 mL比色管中，測(cè)定清除率。④料液比對(duì)清除率的影響。稱取葡萄子研磨粉1.000 g于250 mL錐形瓶中，分別按料液比1∶25、1∶40、1∶50加入60%乙醇，以80℃水浴加熱2.0 h，過濾得浸提液，然后每次用移液管抽取浸提液2.5 mL置于25 mL比色管中，測(cè)定清除率。

1.2.3 正交試驗(yàn) 為了系統(tǒng)考察葡萄子浸提液對(duì)亞硝酸鈉的消除作用以及對(duì)N-亞硝基化合物合成的阻斷作用的最佳浸提工藝條件，選用了L16（45）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，因素與水平見表1。分別以對(duì)亞硝酸鈉清除率和對(duì)N-亞硝基化合物合成的阻斷率作為考察指標(biāo)，得到32個(gè)浸提液樣品，從而確定各考察指標(biāo)下的最佳浸提工藝條件。

1.2.4 亞硝酸鈉清除率的測(cè)定 亞硝酸鹽在弱酸性的條件下能與對(duì)氨基苯磺酸重氮化，再與N-1-萘乙二胺鹽酸鹽偶合生成紅色化合物。取葡萄子浸提液2.5 mL于25 mL比色管中，加入12.5 mL pH 3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖液，再加入100 mg/L NaNO2溶液2.5 mL，用去離子水定容至刻度，于37 ℃恒溫1.5 h，然后各吸取1.0 mL反應(yīng)液于小試管中，加入4 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液2.0 mL、2 g/L N-1-萘乙二胺鹽酸鹽溶液2.0 mL，搖勻放置15 min后，用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)為540 nm處測(cè)吸光度，分別用相應(yīng)濃度相同用量的浸提劑作空白對(duì)照，最后計(jì)算清除率[16，17]。清除率=（A0-Ax）/A0×100%。其中，A0表示加入相應(yīng)浸提劑空白試驗(yàn)的吸光度，Ax表示加入不同濃度浸提液時(shí)的吸光度。按上述方法，另分別取最佳浸提工藝條件下獲得的葡萄子浸提液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL進(jìn)行亞硝酸鹽清除率的濃度梯度測(cè)定，計(jì)算每一濃度下的清除率。

1.2.5 N-亞硝基化合物合成阻斷率的測(cè)定 在模擬人體胃液的條件下，二甲胺與亞硝酸鈉在pH 3.0、37 ℃條件下可生成二甲基亞硝胺（NDMA）。當(dāng)往葡萄子浸提液中依次加入二甲胺與亞硝酸鈉時(shí)，浸提液中的活性物質(zhì)先于二甲胺同亞硝酸鈉作用，達(dá)到阻止NDMA生成的目的。據(jù)此可以通過比較相同條件下生成NDMA的多少來(lái)反映浸提液阻斷能力的強(qiáng)弱，生成NDMA量少，浸提液的阻斷能力就強(qiáng)，反之則弱。在紫外光照射下，NDMA可分解成二甲基仲胺和亞硝酸根，亞硝酸根與對(duì)氨基苯磺酸重氮化后，再與α-萘胺偶合生成紅色化合物。用分光光度計(jì)測(cè)出該化合物的吸光度可計(jì)算上述反應(yīng)液中NDMA含量的多少[11，16]。

取浸提液2.0 mL于25 mL比色管中，加入pH 3.0的檸檬酸鈉-鹽酸緩沖溶液10 mL、1.0 mmol/L NaNO2溶液1.0 mL、1.0 mmol/L二甲胺溶液1.0 mL，再用去離子水定容至刻度，在37 ℃下恒溫1 h。用移液管吸取1.0 mL上述含NDMA的反應(yīng)液加到小試管中，加入5 g/L Na2CO3溶液0.5 mL，于遮光布遮蓋的紫外分析儀上照15 min，紫外燈距液面15 cm，取出后加1 g/L對(duì)氨基苯磺酸溶液1.5 mL，再加1 g/L α-萘胺1.5 mL、0.5 mL去離子水，搖勻放置15 min后，用分光光度計(jì)在525 nm處測(cè)吸光度（A）。同時(shí)分別用相應(yīng)浸提劑做空白試驗(yàn)，并計(jì)算阻斷率。阻斷率=（A0-Ax）/A0×100%，式中，A0為加入相應(yīng)浸提劑空白試驗(yàn)的吸光度；Ax為加入不同濃度浸提液時(shí)的吸光度。按上述方法，另分別取最佳條件的浸提液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL進(jìn)行阻斷NDMA的濃度梯度的測(cè)定，計(jì)算每一濃度下的阻斷率。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 水浴溫度對(duì)清除率的影響 由表1可知，隨著水浴溫度的增加，浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時(shí)清除率達(dá)到最大值。因此，初步確定水浴溫度為80 ℃。

2.1.2 浸提時(shí)間對(duì)清除率的影響 由表2可知，隨著浸提時(shí)間的增加，浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除率呈增加趨勢(shì)，當(dāng)浸提時(shí)間為2.0 h時(shí)清除率達(dá)到最大值。因此，初步確定浸提時(shí)間為2.0 h。

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)清除率的影響 由表3可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到60%時(shí)，浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除率達(dá)到最大，低于或高于此體積分?jǐn)?shù)時(shí)清除率都有所降低。因此，初步確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%。

2.1.4 料液比對(duì)清除率的影響 由表4可知，當(dāng)料液比為1∶40時(shí)，浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除率達(dá)到最大，低于或高于此料液比時(shí)清除率均有所下降。因此，初步確定料液比為1∶40。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由表5可知，以亞硝酸鈉清除率為考察指標(biāo)時(shí)，葡萄子活性物質(zhì)浸提條件的最佳因素組合為A4B4C4D1，即用70%的乙醇溶液以1∶25的料液比在沸騰回流條件下浸提2.0 h所得的葡萄子浸提液清除亞硝酸鈉的效果最佳。通過極差分析可知，各因素對(duì)結(jié)果影響大小的順序?yàn)镃>B>A>D，即浸提溫度影響最大，浸提時(shí)間影響最小。

由表6可知，以NDMA合成的阻斷率為考察指標(biāo)時(shí)，葡萄子活性物質(zhì)浸提條件的最佳因素組合為A3B3C4D1，即用60%的乙醇溶液以1∶40的料液比在沸騰回流條件下浸提2.0 h所得的葡萄子浸提液對(duì)阻斷NDMA合成的效果最佳。通過極差分析可知，各因素對(duì)結(jié)果影響大小的順序?yàn)锽>A>C>D，即料液比影響最大，浸提時(shí)間影響最小。

根據(jù)最優(yōu)方案的確定方法[18]，以不同考察指標(biāo)理論計(jì)算所獲得的最佳提取條件進(jìn)行浸提，與已完成的試驗(yàn)組結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。當(dāng)以亞硝酸鈉清除率為考察指標(biāo)時(shí)，按表5確定的最佳浸提條件A4B4C4D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由表7可知，該浸提條件下獲得的浸提液對(duì)亞硝酸鈉清除率為90.2%，高于表5中已進(jìn)行過的16組試驗(yàn)的結(jié)果，因此，由極差分析推斷的組合A4B4C4D1為亞硝酸鈉清除效果最佳的浸提工藝條件組合。

當(dāng)以NDMA合成的阻斷率為考察指標(biāo)時(shí)，按由表6通過極差分析確定的最佳浸提條件A3B3C4D1進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，由表8可知，該條件下其對(duì)NDMA合成的阻斷率為81.2%，低于已進(jìn)行的表6中試驗(yàn)組12的阻斷率86.0%，出現(xiàn)這種情況的原因可能由于試驗(yàn)因素之間的交互作用[18]。因此，以NDMA合成的阻斷率為考察指標(biāo)時(shí)，其最佳浸提工藝條件為表6中試驗(yàn)組12的條件（A3B4C2D1），即用60%的乙醇溶液以1∶25的料液比在60 ℃水浴條件下浸提2.0 h。

2.3 不同用量的葡萄子浸提液清除亞硝酸鈉、阻斷NDMA合成的測(cè)定結(jié)果

2.3.1 清除亞硝酸鈉的測(cè)定結(jié)果 在以亞硝酸鈉清除率作為考察指標(biāo)而確定的最佳浸提條件（A4B4C4D1）下獲得浸提液，考察不同用量的葡萄子浸提液清除亞硝酸鈉的結(jié)果。由圖1可知，隨著葡萄子浸提液用量的增多，對(duì)亞硝酸鈉的清除率先升高，至最高值后又下降。當(dāng)浸提液用量為0.5～1.0 mL時(shí)，對(duì)亞硝酸鈉的清除率由73.8%提高至峰值90.4%。該過程的最大清除率為90.4%。

2.3.2 阻斷NDMA合成的測(cè)定結(jié)果 由圖2可知，隨著葡萄子浸提液（A3B4C2D1條件下浸提所得）用量的增多，對(duì)NDMA合成的阻斷率波動(dòng)上升后持續(xù)降低。當(dāng)浸提液用量為0.5～1.0 mL時(shí)阻斷率由76.8%迅速升至86.2%，隨后當(dāng)浸提液用量為1.0、1.5、2.0 mL時(shí)阻斷率近乎保持不變，然后當(dāng)浸提液用量為2.5 mL時(shí)，阻斷率升至峰值88.0%，后隨著浸提液用量的增加，阻斷率持續(xù)下降，當(dāng)浸提液用量為5.0 mL時(shí)，阻斷率為77.1%。該過程的最大阻斷率為88.0%。出現(xiàn)此現(xiàn)象的原因可能由于在加樣量為2.5 mL時(shí)達(dá)到了浸提液與亞硝酸鈉反應(yīng)的最適濃度，在此之前，未達(dá)到該濃度而使得反應(yīng)量處于一個(gè)相對(duì)低點(diǎn)。而當(dāng)加樣量超過2.5 mL時(shí)，阻斷率下降，這可能是因?yàn)槠咸炎又泻胸S富的黃酮類化合物，而當(dāng)黃酮類化合物濃度過高時(shí)，容易發(fā)生自身氧化聚合而導(dǎo)致浸提液活性降低[17，19]。

3 結(jié)論

在體外模擬胃液，即pH 3.0、37 ℃的條件下，葡萄子浸提液能有效地清除亞硝酸鹽和阻斷NDMA的生成。通過四因素四水平正交試驗(yàn)確定了浸提葡萄子中活性成分的最佳浸提工藝條件：以對(duì)亞硝酸鈉清除率為考察指標(biāo)時(shí)，浸提葡萄子中的活性成分的最佳條件是按料液比1∶25加入70%的乙醇浸泡，在沸騰回流條件下浸提2.0 h；以對(duì)NDMA合成的阻斷率為考察指標(biāo)時(shí)，浸提葡萄子中的活性成分的最佳條件是按料液比1∶25加入60%的乙醇浸泡，在60 ℃浸提2.0 h。

在以亞硝酸鈉清除率作為考察指標(biāo)的最佳提取條件下浸提，葡萄子浸提液對(duì)亞硝酸鈉的最大清除率為90.2%；在以NDMA合成的阻斷率作為考察指標(biāo)的最佳提取條件下浸提，葡萄子浸提液對(duì)NDMA合成的最大阻斷率為86.0%。研究進(jìn)一步考察了最佳提取工藝條件下不同用量葡萄子浸提液對(duì)亞硝酸鈉的清除作用及對(duì)NDMA合成的阻斷作用，結(jié)果表明，以對(duì)亞硝酸鈉清除率為考察指標(biāo)時(shí)，在浸提液用量為1.0 mL時(shí)達(dá)到90.4%的清除率；以對(duì)NDMA合成的阻斷率為考察指標(biāo)時(shí)，在浸提液用量為2.5 mL時(shí)，達(dá)到88.0%的阻斷率。

中國(guó)有著豐富的葡萄資源，葡萄子是葡萄酒廠以及葡萄飲料廠的下腳料，大多數(shù)酒廠或飲料廠常將其丟棄或發(fā)酵后用做肥料，尚未對(duì)其進(jìn)行增值利用。葡萄子浸提液能夠有效地阻斷NDMA的合成和清除亞硝酸鈉，作為防癌功能開發(fā)利用前景可觀。

參考文獻(xiàn)：

[1] 歐陽(yáng)學(xué)農(nóng).癌癥疼痛治療概況[J].福州總醫(yī)院學(xué)報(bào)，2010，17（4）：258-260.

[2] 白永文，王明強(qiáng).N-亞硝基化合物對(duì)食品安全的污染及其對(duì)策[J].中國(guó)調(diào)味品，2011，36（8）：9-11.

[3] 魏法山，徐幸蓮，周光宏. 揮發(fā)性N-亞硝基化合物的分析方法[J].食品科學(xué)，2008，29（7）：479-484.

[4] 馬儷珍，楊 華，閻 旭，等. 鹽水火腿加工中影響亞硝基化合物生成因素的研究[J]. 食品科學(xué)，2007，28（1）：82-85.

[5] 袁毅樺，陳 忻，陳純馨，等. 柚皮提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)抑制作用研究[J].化學(xué)世界，2004（1）：26-28.

[6] 郭青枝，趙二勞，范建鳳. 金蓮花黃色素對(duì)亞硝化反應(yīng)抑制作用的研究[J]. 山西大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2009，32（1）：100-103.

[7] 傅茂潤(rùn)，陳慶敏，茅林春. 黃花菜提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制能力研究[J]. 食品科學(xué)，2009，30（15）：114-119.

[8] 黃高凌，翁聰澤，倪 輝，等. 琯溪蜜柚果皮提取物抑制亞硝化反應(yīng)的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（12）：36-39.

[9] 吳 佳，解成喜.石榴皮總黃酮的提取工藝及抑制亞硝化反應(yīng)[J].食品科學(xué)，2011，32（2）：111-114.

[10] 郭艷華，邱紅心，張遠(yuǎn)方，等.魚腥草中有效化學(xué)成分對(duì)N-亞硝化反應(yīng)的阻斷作用[J].食品科學(xué)，2010，31（23）：72-75.

[11] 林 敏，馬志強(qiáng)，吳冬青，等. 鵝絨藤提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)抑制作用研究[J]. 中獸醫(yī)醫(yī)藥雜志，2011（1）：36-39.

[12] 張 虹，許 鋼，袁建耀. 劉寄奴提取液對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用[J]. 鄭州糧食學(xué)院學(xué)報(bào)，2000，21（1）：50-53.

[13] 左 媛，王曉聞. 葡萄籽提取物研究進(jìn)展綜述[J]. 山西科技，2010，25（3）：138-139.

[14] PASSWATER R A，KANDASWAMI C. Pyconogenol：The super “protector” nutrient [M]. New York，USA：McGraw-Hill，1998.

[15] BAGCHI D，KROHN R L，GARG A，et al. Comparative in vitro and in vivo free radicals scavenging abilities of grape seed proan-thocyanidins and selected antioxidants[J]. The FASEB Journal，1997，11（3）：4-11.

[16] 郭艷華，胡思前.荸薺皮提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)抑制作用研究[J].食品與機(jī)械，2008，24（3）：64-66.

[17] 吳 春，張立惠，孔 琪，等. 杜仲提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用[J].化學(xué)與黏合，2005，27（3）：27-31.

[18] 陳坤杰，張偉林. 大學(xué)生科研訓(xùn)練教程[M].合肥：合肥工業(yè)大學(xué)出版社，2010.

[19] 朱蔽瑞.榛葉提取物對(duì)亞硝化反應(yīng)的抑制作用[J].黑龍江醫(yī)藥，2007，20（2）：112-113.