苦馬豆素人工抗原免疫小鼠的安全性試驗

摘要：通過分析苦馬豆素（Swainsonine，SW）人工抗原SW-OVA對小鼠機體的影響，進行安全性評價。將36只昆明種小鼠隨機分為對照組、試驗Ⅰ組、試驗Ⅱ組，每組12只。試驗組依次進行首免和加強免疫，免疫前采血，分析血清生化指標谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、堿性磷酸酶（AKP）、乳酸脫氫酶（LDH）、α-甘露糖苷酶（AMA）、尿素氮（BUN）的變化，血常規(guī)指標紅細胞數(shù)（RBC）、白細胞數(shù)（WBC）、淋巴細胞數(shù)（LYM）、血小板數(shù)（PLT）和血紅蛋白含量（HGB）的變化，同時檢測免疫組血清中有無SW，并觀察小鼠臟器系數(shù)及其形態(tài)學變化。結果表明，免疫組小鼠與對照組小鼠血清生化指標、血常規(guī)指標和臟器系數(shù)差異不大，免疫小鼠血清中未檢出SW，鏡檢未見免疫小鼠器官出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。合成的人工抗原SW-OVA具有較好的安全性。

關鍵詞：苦馬豆素（Swainsonine，SW）；人工抗原；免疫；小鼠

中圖分類號：S852.4 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3370-03

苦馬豆素（Swainsonine，SW）是豆科棘豆屬（Oxytropis）和黃芪屬（Astragalas）等瘋草植物的主要有毒成分[1]。瘋草在中國分布廣泛，目前對瘋草蔓延采取的防除方法主要有人工挖除、化學藥劑滅除等。其中人工挖除僅適用于小面積草場，而且效果并不理想；化學藥劑滅除極易造成環(huán)境污染，不利于畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[2]。瘋草為豆科植物，營養(yǎng)成分較為全面[3]。

目前利用免疫預防的方法使家畜安全利用瘋草，已經(jīng)成為了國內研究的熱點[4]。SW分子量小，屬于半抗原，不具有免疫原性。需要將SW與大分子載體蛋白偶聯(lián)合成人工抗原，將合成的人工抗原用于動物免疫，即可誘導動物機體產(chǎn)生抗SW的特異性抗體，使動物獲得對瘋草的免疫力。但合成的人工抗原有可能在機體降解釋放出SW，故需要對其進行安全性評估。本試驗用人工合成抗原SW-卵清蛋白（Ovalbumin，OVA）免疫昆明種小鼠，通過分析血清生化指標、血常規(guī)指標和臟器系數(shù)，檢測SW-OVA對免疫小鼠機體的影響，并監(jiān)測小鼠血液中有無SW，以探討SW-OVA對動物機體的影響，為抗SW單克隆抗體的制備奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

昆明種小鼠36只，雌雄各半，體重（22±2）g，購自塔里木大學動物科學學院實驗站。

1.2 試劑與儀器

SW-OVA由新疆生產(chǎn)建設兵團塔里木畜牧科技重點實驗室制備；弗氏完全佐劑（FAC）、弗氏不完全佐劑（FAI）購自Sigma公司；谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、尿素氮（BUN）、α-甘露糖苷酶（AMA）檢測試劑盒購自南京建成生物技術有限公司；其余常規(guī)試劑均為國產(chǎn)分析純。

Carry 100型紫外-可見分光光度計（無錫天牧儀器科技有限公司）；DK-8D型電熱恒溫水槽（上海精宏實驗設備有限公司）；BS124型精密電子天平（德國賽多力斯）；VetTest 8008型生化分析儀、StatSpin VT型離心機（北京安普生化科技有限公司）；Direct-Q3型超純水系統(tǒng)（美國Millipore）。

1.3 抗原的制備

按不同免疫劑量精確稱取SW-OVA溶解于一定體積的生理鹽水中，加入等量佐劑混勻，至完全形成白色油包水型乳濁液，小鼠注射劑量為0.2 mL。首免時佐劑使用FAC，第一次和第二次加強免疫佐劑使用FAI，第三次加強免疫不使用佐劑，完全使用生理鹽水溶解。

1.4 小鼠免疫試驗

參考王帥等[5]的研究進行免疫試驗，對各免疫組使用FAC進行基礎免疫，再以相同免疫途徑進行首免和加強免疫。各免疫組免疫劑量和免疫時間見表1。對照組每次注射等體積的抗原乳化液。

1.5 血樣采集及血液指標測定

在每次免疫的當天早晨對每組隨機取3只小鼠，眼眶取血。當日下午進行免疫操作，共采血4次。采回的全血3 000 r/min分離血清，進行臨床生化指標測定。血清檢測的指標有：谷草轉氨酶（AST）、谷丙轉氨酶（ALT）、乳酸脫氫酶（LDH）、堿性磷酸酶（AKP）、α-甘露糖苷酶（AMA）、尿素氮（BUN）?？鼓糜跍y定血常規(guī)指標：紅細胞數(shù)（RBC）、白細胞數(shù)（WBC）、淋巴細胞數(shù)（LYM）、血小板數(shù)（PLT）和血紅蛋白含量（HGB）。

1.6 免疫小鼠血清中SW的定性檢測

參考宋毓民等[6]的研究對血清進行前處理，采用薄層層析（TLC）檢查是否含有SW。TLC條件參照文獻[7]，若薄層板Rf為0.48左右處出現(xiàn)紫紅色斑點則判定為檢測到SW，否則判定檢液不含SW。

1.7 試驗小鼠臟器系數(shù)檢測及器官的組織學觀察

每次采血的同時采取小鼠心、肝、脾、肺、腎，準確稱量記錄各臟器重量。計算出臟器系數(shù)：臟器系數(shù)=（臟器重/體重）×100%。然后將各器官置于10%的福爾馬林溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，間隔連續(xù)切片，HE染色，鏡檢。

1.8 數(shù)據(jù)分析

試驗數(shù)據(jù)用Excel進行處理，數(shù)據(jù)分析用SPSS 11.5中One-Way ANOVA進行單因素方差分析，采用Duncan新復極差法（SSR）進行多重比較，結果以（平均數(shù)±標準差）表示。

2 結果與分析

2.1 免疫小鼠血清中SW的定性檢測結果

從第一次采血開始，到第四次時，試驗Ⅰ組和試驗Ⅱ組小鼠的血清中未檢測到SW。

2.2 試驗小鼠器官的組織學檢測結果

所有試驗組小鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器均未見明顯的眼觀變化；由表2可知，免疫組與對照組各臟器系數(shù)差異不大；鏡檢各器官組織切片，也未見到細胞空泡變性、細胞核壞死、溶解、消失等SW中毒的典型癥狀。

2.3 試驗小鼠血清生化指標測定結果

由表3可知，整個試驗期內所有試驗小鼠血清AST、ALT、LDH、AKP、AMA、BUN、RBC、WBC、LYM、PLT和HGB均變化不大。

3 討論

SW為半抗原，不具有完全的免疫原性，只有將其偶聯(lián)到大分子載體上才能誘導出免疫原性[5]。SW易溶于水，可被動物機體迅速吸收，并很快通過循環(huán)系統(tǒng)和排泄系統(tǒng)排出體外，故可對動物體液進行SW檢測，以確定其安全性[7]。本試驗中免疫小鼠血清SW檢測為陰性，說明小鼠機體中無SW單體。本試驗使用的薄層色譜法靈敏度雖然較低，但其對SW的檢測下限（0.5 μg）已遠低于小鼠的中毒劑量[8]，可以用于檢測動物體液中是否含有SW。

據(jù)國內外研究SW可特異性地抑制α-甘露糖苷酶的活性，α-甘露糖苷酶活性的下降是檢測動物瘋草中毒最重要的指標[9]。正常情況下AST和ALT主要存在于肝細胞線粒體內，當肝臟發(fā)生嚴重壞死時，可檢測到血清中AST和ALT濃度升高[10]。BUN是機體蛋白質的代謝產(chǎn)物，血液中BUN含量的變化反映了腎臟排氮功能的障礙[9]。LDH存在于機體組織細胞的胞質內，當動物肝臟和心臟等發(fā)生損傷時，血清LDH值會急速升高[10]。AKP是臨床檢測中具有重要意義的一種酶，主要分布于肝、腎和骨組織中，當動物肝臟組織病變時其活性會異常升高。本試驗中免疫小鼠的血清生化指標值與對照小鼠差異不大，表明合成的SW-OVA沒有對小鼠造成病理性損害，可以作為生物技術藥品用于小鼠。

白細胞是血液中重要的一類血細胞，具有吞噬異物并產(chǎn)生抗體的作用，有對機體傷病的損傷治愈能力和抗御病原體入侵的能力，以及對疾病的免疫抵抗力等。淋巴細胞是白細胞的一種，由淋巴器官產(chǎn)生，機體免疫應答功能的重要細胞成分[11]。紅細胞是血液中數(shù)量最多的血細胞，同時也是脊椎動物體內通過血液運送氧氣的最主要的媒介，同時還具有免疫功能。血紅蛋白含量是判斷機體是否貧血的重要指標[12]。血小板是哺乳動物血液中的有形成分之一，具有特定的形態(tài)結構和生化組成，在正常血液中有較恒定的數(shù)量[13]。本試驗中免疫小鼠的血常規(guī)指標值與對照組差異不大，表明合成的SW-OVA對小鼠具有較好的安全性。

臟器系數(shù)是毒理學實驗中較為重要的指標，反映了受試物對臟器的損害程度[14]。但臟器系數(shù)的變化只能說明動物的某個臟器受到受試物的損傷，仍需要進行進一步的病理組織學及有關生化指標的檢查。試驗組和對照組的小鼠各臟器系數(shù)均無顯著性差異，切片鏡檢也未發(fā)現(xiàn)小鼠臟器的毒理性變化，血清生化指標和血液學指標未見異常變化，合成的SW-OVA安全性較好，具有較好的利用前景。

4 結論

本試驗以小鼠為研究對象，通過檢測血液和組織學指標，結果發(fā)現(xiàn)免疫小鼠血清生化指標、血常規(guī)指標及臟器系數(shù)與對照組差異不大，而且免疫小鼠血清中未檢測到SW，鏡檢未發(fā)現(xiàn)組織器官有中毒現(xiàn)象。說明人工抗原SW-OVA可以安全地利用于小鼠。

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