仙客來葉斑病侵染特性觀察

摘要：為仙客來（Cyclamen premium Mill）葉斑病的起源、發(fā)生、傳播和防治研究提供形態(tài)解剖學(xué)依據(jù)，利用石蠟切片和掃描電鏡觀察患葉斑病的仙客來葉片，研究病原菌在葉片中的分布和侵染特點。結(jié)果表明，葉斑病病原菌先通過菌絲從葉片氣孔侵入，進入海綿組織中產(chǎn)生孢子，再向其他部位蔓延。葉斑病病原菌在侵染過程中產(chǎn)生了墊、塞和釘狀的特殊侵染結(jié)構(gòu)。

關(guān)鍵詞：仙客來；葉斑??；侵染特點；侵染結(jié)構(gòu)

中圖分類號：S436.8 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3302-04

仙客來（Cyclamen premium Mill）為報春花科（Myrsinaceae）仙客來屬（Cyclamen）多年生球根草本植物，是世界著名的節(jié)日小盆花之一。仙客來葉斑病（Leaf spot disease）是近幾年發(fā)生并報道的一種新的葉部病害，發(fā)病率一般為20%～30%，嚴重時可達50%，給生產(chǎn)造成了巨大損失。葉斑病在3月上旬始見，5～6月為流行高峰期。病害發(fā)生主要與氣候、栽培管理和品種密切相關(guān)[1，2]。葉斑病是春季溫室中仙客來的多發(fā)病，危害嚴重，發(fā)病速度快，暴發(fā)力強[3]。目前有關(guān)仙客來葉斑病的研究主要集中在病原鑒定、診斷和防治等方面[4]，而對患病植株組織內(nèi)部變化研究報道較少，對患葉斑病葉片細胞超微結(jié)構(gòu)的變化過程研究不夠詳細全面，缺乏系統(tǒng)性。本研究對患葉斑病的仙客來葉片顯微結(jié)構(gòu)進行了系統(tǒng)觀察研究，以期揭示葉斑病侵染特點，為進一步研究仙客來葉斑病的起源、發(fā)生、傳播及防治提供解剖學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

取患葉斑病的仙客來植株和正常仙客來植株的葉片，患病葉包括以下時期：時期I，葉無明顯變化到葉背面花斑無明顯增加，葉較正常；時期Ⅱ，出現(xiàn)小型斑點，但葉片整體狀態(tài)較好；時期Ⅲ，出現(xiàn)大型斑點，葉片出現(xiàn)干枯癥狀；時期Ⅳ，葉片出現(xiàn)大量斑點，葉片接近完全干枯。利用石蠟切片技術(shù)處理樣品（切片厚度10 μm），經(jīng)過番紅-固綠滴染和番紅-固綠-龍膽紫滴染后封固，在光學(xué)顯微鏡下觀察，并用電子顯微鏡觀察仙客來葉表皮。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌侵染仙客來葉片的位置

仙客來葉斑病的典型特點就是在葉片上形成一些斑點，從而影響其觀賞性。在病原菌侵染時，葉片發(fā)病多從葉緣開始，有時也從葉中部始發(fā)，初期葉片上產(chǎn)生淡綠色水漬狀小圓斑，后期病斑擴展、呈淡褐色、邊緣下陷，由于受葉脈限制，愈合成不規(guī)則的大病斑，具不明顯的暗色輪紋，中央灰白色，危害嚴重時病斑中央枯死。試驗對葉斑病病菌侵染不同時期的仙客來葉片進行石蠟切片觀察，采用番紅-固綠雙染法和番紅-固綠-龍膽紫三染法進行染色，在雙染法中植物細胞內(nèi)的菌絲被染成綠色，而孢子被染成紅色；在三染法中，正常細胞壁被染成綠色，孢子為紅色，菌絲為紫色。從觀察結(jié)果（圖1）可以看出，葉斑病的病原菌大部分是從葉片的下表皮氣孔處開始侵染，同時在保衛(wèi)細胞中產(chǎn)生菌絲，然后在葉肉細胞中產(chǎn)生大量的分生孢子，從而實現(xiàn)在植物葉中的傳播，在掃描電鏡觀察中也看到了相同的現(xiàn)象。病原菌的大部分侵入點在下表皮的氣孔位置，只有在葉片已經(jīng)枯萎時，才在葉片上表皮看到一些侵入點，這些侵入點形成的原因可能是在病原菌的作用下，葉片表皮的角質(zhì)層受到破壞，同時表皮細胞受到破壞。

2.2 葉片中病原菌的分布情況

觀察不同時期的仙客來葉片的解剖結(jié)構(gòu)，病原菌在葉片不同組織中分布情況及狀態(tài)見表1。從表1可見，葉片中菌絲與孢子對下表皮和葉肉組織侵染嚴重，上表皮侵染較輕，而葉脈沒有侵染跡象。菌絲的分布多為絮狀，并且成團，孢子為顆粒狀（圖1B），菌絲與孢子充滿并破壞細胞。菌絲在葉片海綿組織、下表皮、柵欄組織中的分布呈現(xiàn)出逐漸增多的趨勢，而孢子主要分布在海綿組織，表明病原菌可能是通過菌絲侵入葉片，然后進入海綿組織產(chǎn)孢，進而形成菌絲，再向其他部位蔓延。

2.3 仙客來葉斑病病原菌侵染過程

通過掃描電鏡觀察不同時期的仙客來葉片，從而確定病原菌的侵染過程。發(fā)現(xiàn)葉斑病病原菌通過葉片下表皮氣孔侵入葉片內(nèi)部。正常葉片表皮細胞排列緊密，外面覆蓋厚的角質(zhì)層，氣孔正常，外形規(guī)則，并且保衛(wèi)細胞飽滿（圖2A）。在侵染初期，一些孢子附著在葉片的下表皮上，向氣孔內(nèi)形成菌絲，然后侵入閉合氣孔，這些菌絲快速生長發(fā)育并大量繁殖。一部分穿過氣孔進入葉片內(nèi)層細胞中，通過菌絲將孢子帶入內(nèi)層細胞中，破壞葉片內(nèi)部組織，石蠟切片也觀察到相同的結(jié)果（圖1A）。另一部分病原菌向外生長破環(huán)氣孔的保衛(wèi)細胞，使其失活無法收縮，并且繼續(xù)破壞氣孔，使其逐漸失水收縮（圖2B）。

隨著侵染進程的發(fā)展，菌絲繼續(xù)生長并且在氣孔處集結(jié)形成了一些墊、塞和釘狀結(jié)構(gòu)（圖3），在侵染后期，這些侵染結(jié)構(gòu)不斷堆積，會形成錐、柱等不規(guī)則結(jié)構(gòu)，并出現(xiàn)了斷裂、坍塌的現(xiàn)象。在這些結(jié)構(gòu)中可以看到大量孢子，而落在表皮上的孢子又開始萌發(fā)，產(chǎn)生新的菌絲，繼續(xù)侵染臨近氣孔。

在侵染末期，葉片表皮細胞開始失水萎縮，角質(zhì)層受到嚴重的破壞，完好氣孔較少，幾乎所有的氣孔都有侵入結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。這時葉片的外部表現(xiàn)為出現(xiàn)了大塊的斑點。隨著斑點的增加，葉片逐漸出現(xiàn)枯死和變黃的現(xiàn)象。掃描電鏡對葉斑病的病原菌及氣孔在病原菌侵染過程的變化情況觀察結(jié)果見表2。

由電鏡照片（圖4）可以看出，在病原菌侵染過程中，病原菌的孢子形狀為橢圓形，直徑0.82～4.91 μm，并且在剛剛形成時，雖然細胞較小，但是馬上就進行了萌發(fā)從而產(chǎn)生了大量的菌絲，繼續(xù)對葉片進行侵染，這可能也是仙客來葉斑病傳播速度較快的原因之一。在病原菌對葉片的侵染過程中，氣孔發(fā)生了巨大的變化，正常氣孔的直徑為44.10 μm，而受到破壞后其直徑縮小為19.50 μm，表明在病原菌侵染過程中，保衛(wèi)細胞明顯縮水變形。氣孔受到破壞時也失去了正常的功能，始終處于張開狀態(tài)。

隨侵染癥狀加劇，菌絲形成的外部結(jié)構(gòu)逐漸變大發(fā)生破碎，破碎面呈針狀、柵欄狀，釋放出大量孢子。通過石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)孢子多聚集在菌絲邊緣部位，推測孢子是通過菌絲傳遞到氣孔，并傳遞到葉肉細胞內(nèi)部，使侵染面積擴大。觀察發(fā)現(xiàn)，隨著侵染癥狀加劇，葉下表皮的孢子數(shù)呈先增加后減少的趨勢，說明大部分的孢子已轉(zhuǎn)移到葉片內(nèi)部，葉表皮已經(jīng)被破壞。

3 討論

3.1 組織學(xué)觀察和細胞學(xué)觀察的方法比較

植物結(jié)構(gòu)常使用組織學(xué)觀察和細胞學(xué)觀察，組織學(xué)觀察采用光學(xué)顯微鏡，標本制作常用石蠟切片方法，細胞學(xué)觀察常采用電子顯微鏡。本試驗采用石蠟切片并結(jié)合不同的染色方法對仙客來葉斑病病原菌侵染特點進行了觀察，雙染法將細胞和菌絲染成綠色，孢子染成紅色；三染法將菌絲染成紫色、細胞染為綠色、孢子染為紅色，更易分辨其結(jié)構(gòu)，是觀察植物體內(nèi)病原菌情況的較好方法。在試驗中，特別是采用三染法的時候，一定要控制好各個藥品的染色時間，才能保證制片染色均勻。龍膽紫和固綠較容易著色，染色后應(yīng)立即清洗，番紅較難著色，應(yīng)多染些時間，染色為2～3 min。電子顯微鏡與光學(xué)顯微鏡相比，操作時間短，工序更簡單，而且可以更清晰觀察組織變化、較準確測量孢子的大小。

3.2 仙客來葉斑病的侵染結(jié)構(gòu)

植物病原菌要實現(xiàn)對植物體的侵害，必須先侵入到植物體中[5]。病原菌在入侵寄主時，通常會產(chǎn)生一些由特化菌絲形成的侵染結(jié)構(gòu)，如侵染墊（Infection cushion）[6，7]、附著胞（Appressorium）[8]、侵染釘（Penetration peg） 、吸器（Haustorium）[9，10]，幫助入侵并與寄主建立寄生關(guān)系。病原菌在侵染植物時，多數(shù)是菌絲體直接穿過表皮細胞或細胞間隙。病原菌侵染可歸納為以通過特殊的侵染結(jié)構(gòu)（侵染墊或裂片狀附著胞）進行侵染和由菌絲頂端直接穿透植物表面或從自然孔口（主要是氣孔）及傷口直接侵入兩種情況[11，12]，具體情況與菌株和寄主不同有關(guān)系。

在對仙客來葉斑病病原菌侵染過程觀察中，發(fā)現(xiàn)菌絲在氣孔外圍形成了一些特殊的侵染結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)由菌絲構(gòu)成，開始為較小的塞和釘狀結(jié)構(gòu)，隨侵入過程的發(fā)展，這些結(jié)構(gòu)形成較大的錐和柱等不規(guī)則結(jié)構(gòu)。葉片的表皮細胞在侵染后期出現(xiàn)縮水和萎縮現(xiàn)象，沒有發(fā)現(xiàn)菌絲直接穿透表皮細胞，可見葉斑病對葉片的侵染是通過產(chǎn)生特殊結(jié)構(gòu)的方式來實現(xiàn)的。隨侵染癥狀的逐漸加劇，菌絲形成的外部結(jié)構(gòu)逐漸變大破碎，破碎面呈針狀、柵欄狀，釋放出大量孢子。通過石蠟切片觀察，發(fā)現(xiàn)孢子多聚集在菌絲邊緣部位，推測孢子是通過菌絲傳遞到氣孔，并傳遞到葉肉細胞內(nèi)部，使侵染擴大。觀察發(fā)現(xiàn)隨著侵染癥狀加劇，葉下表皮的孢子數(shù)呈先增加后減少的趨勢，說明大部分的孢子已轉(zhuǎn)移到葉片內(nèi)部，表皮已經(jīng)被破壞。

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