土壤中產(chǎn)脲酶微生物分離及對重金屬的固化

摘要：從苗圃土壤中分離具有產(chǎn)脲酶活性的細(xì)菌，對其進(jìn)行鑒定，并利用其對鎳、銅、鉛、鈷、鋅和鎘等重金屬進(jìn)行去除。結(jié)果表明，土壤中產(chǎn)脲酶微生物對鎳、銅、鉛、鈷、鋅和鎘等重金屬的去除率達(dá)88%～99%。土壤中微生物可以通過生物成礦作用，固化土壤和污水中的重金屬。這些微生物可以在重金屬生物修復(fù)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：生物成礦；重金屬；產(chǎn)脲酶微生物；碳酸鹽沉積

中圖分類號：Q93-331；X53 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）14-3280-03

重金屬是一類移動性差、難以降解并具有潛在危害的重要土壤污染物。重金屬污染是指由于人類的生產(chǎn)和活動，致使環(huán)境中重金屬含量明顯高于其背景值，由于重金屬離子具有長期滯留和不可降解的特性，對生態(tài)環(huán)境造成了極大破壞。在金屬礦床開發(fā)及冶煉、固體廢棄物堆積以及為提高農(nóng)業(yè)產(chǎn)量而使用化肥、農(nóng)藥、污泥及污水灌溉等過程中，導(dǎo)致重金屬在土壤中大量積累。同時隨著大規(guī)模的城市擴張和建設(shè)，許多建筑物建設(shè)在廢棄的工廠及垃圾場附近，地基中重金屬污染嚴(yán)重。重金屬元素能通過食物鏈最終進(jìn)入生物體內(nèi)，破壞生物體正常的新陳代謝，嚴(yán)重危害人體健康，已成為不可忽視的環(huán)境問題[1]。

傳統(tǒng)的重金屬處理方法主要包括化學(xué)沉淀法、離子交換法、蒸發(fā)濃縮法、電解法、活性炭和硅膠吸附法和膜分離法等，但這些方法存在去除不徹底、費用昂貴、產(chǎn)生有毒污泥或其他廢料等缺點。因此，研究與開發(fā)高效環(huán)保型的重金屬處理技術(shù)和工藝成為研究的熱點之一[2，3]。

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，使微生物治理重金屬污染逐漸受到重視。微生物處理法是利用細(xì)菌、真菌、藻類等生物材料及其生命代謝活動去除重金屬，從而降低土壤環(huán)境中重金屬離子的濃度。同傳統(tǒng)處理技術(shù)相比具有明顯優(yōu)勢，如其處理成本低，處理效果好，生化處理后污染物殘留量可達(dá)到很低水平，因而該技術(shù)成為最有發(fā)展?jié)摿褪袌銮熬暗男迯?fù)技術(shù)。碳酸鹽的沉積是生物礦化的一個重要方面，與無機化學(xué)成礦過程相比，生物誘導(dǎo)的礦物晶體，在礦物晶體大小、晶型和微量元素成分等方面都有著明顯的差別[4]。微生物誘導(dǎo)的碳酸鈣礦物，在生物修復(fù)放射性元素污染，如鍶（Sr）、鋇（Ba）等的修復(fù)方面有著廣泛的應(yīng)用[5，6]。碳酸鹽的沉積很多基于脲酶分解尿素，生成CO32-和氨，增加環(huán)境pH，從而使環(huán)境中陽離子與碳酸根結(jié)合形成碳酸鹽礦物[4]。

研究利用從土壤中分離的產(chǎn)脲酶微生物，使重金屬生成重金屬碳酸鹽礦物，使其由活化態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定態(tài)，從而達(dá)到固化環(huán)境中重金屬污染的目的。

1 材料與方法

1.1 供試菌株及培養(yǎng)基

巴氏芽孢桿菌八疊球菌（Sporosarcina pasteurii）購自于美國模式培養(yǎng)物集存庫（American type culture collection），編號為ATCC11859，腫大地桿菌（Terrabacter tumescens） 購自于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號為AS.1.2690[7]。

脲酶篩選培養(yǎng)基：蛋白胨0.1 g，氯化鈉 0.5 g，磷酸二氫鉀 0.2 g，尿素 0.2 g，葡萄糖0.01 g，加水至100 mL，再加入酚紅（0.2%）0.4 mL。

除葡萄糖、尿素外把其他藥品稱好放入水中煮沸，使其溶解，調(diào)pH 7.2過濾，高壓滅菌15 min。尿素（滅菌）液配制：每100 mL基液內(nèi)加2 mL。10%葡萄糖（滅菌）液配制：每100 mL加0.1 mL。

1.2 方法

1.2.1 土樣采集及菌種的分離 產(chǎn)脲酶微生物分離自清華大學(xué)花圃。取土壤樣品1.0 g，置于裝有100 mL 5 mol/L尿素培養(yǎng)基的250 mL三角瓶內(nèi)，37 ℃、150 r/min富集培養(yǎng)24 h。取0.1 mL以無菌水稀釋成10-2、10-3和10-4 3個梯度，涂布脲酶篩選培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24～48 h。挑選培養(yǎng)基周圍變紅的菌落劃線培養(yǎng)，獲得單菌落。

1.2.2 微生物濃度及脲酶活性檢測 采用UNICO2000型可見分光光度計檢測微生物濃度，檢測時所用波長為600 nm，所測值用OD600 nm表示。

脲酶活性測量方法為：取1 mL菌液與9 mL 1.1 mol/L尿素溶液混合，用電導(dǎo)率儀測量5 min溶液電導(dǎo)率的變化，所測5 min內(nèi)平均電導(dǎo)率變化值乘以稀釋倍數(shù)，即為菌液酶活性，此值反映了菌液水解尿素的能力，菌液酶活性除以菌液OD600 nm，即為菌液單體酶活性，該值反映了每單位OD600 nm菌液水解尿素的能力[8，9]。

1.2.3 16S rDNA序列分析 微生物基因組DNA的提取采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（天根生化）提取。16S rDNA 序列擴增引物為27F （5′-AGAGT

TTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R （5′-GGTTACCT

TGTTACGACTT-3′）。PCR反應(yīng)條件為95 ℃ 4 min； 94℃ 1 min， 50℃ 1 min，72℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物測序工作由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。序列的拼接使用DNAMAN軟件，并在線（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）與GenBank中的已知序列進(jìn)行Blast比對分析。根據(jù)16S rDNA測序結(jié)果，結(jié)合GenBank中已知芽孢桿菌16S rDNA序列，利用MEGA 4.1軟件，繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。各菌株16S rDNA GenBank登陸號為JN393848～JN393851.

1.2.4 金屬固化試驗 分別取6種菌液1 mL，加入等體積0.5 mol/L 的尿素溶液制成混合溶液，每種菌液制備6種平行樣，再將體積為2 mL的混合溶液分別加入到體積為0.5 mL、濃度為2 g/L的重金屬溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2 以及CdCl2中[10]。Ni、 Cu、Pb、Co、Zn、Cd在溶液中的濃度測定采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法（ICP-AES）IRIS Intrepid II series（Thermo Elemental Co.，USA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)脲酶菌株的分離和篩選結(jié)果

產(chǎn)脲酶菌株分離自清華大學(xué)花圃采集土壤樣品。細(xì)菌具有尿素分解酶，能分解尿素產(chǎn)生大量的氨，使培養(yǎng)基呈堿性，顯紅色。利用這一特性，將試驗樣品先在37 ℃、5 mol/L高濃度尿素條件下富集培養(yǎng)24 h后，殺死不能耐受和利用高濃度尿素的各種微生物營養(yǎng)體細(xì)胞，再將處理后的培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布脲酶篩選培養(yǎng)平板，37 ℃下培養(yǎng)，挑取使培養(yǎng)基顏色變紅的菌株，劃線分離單菌落，獲得的微生物為產(chǎn)脲酶微生物，并利用16S rDNA方法進(jìn)行鑒定，分別命名為Sporosarcina antarctica UR53，Sporosarcina koreensis UR47， Sporosarcina sp. UR31，Bacillus lentus UR41，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號分別為CGMCC No. 5916、CGMCC No. 5915、CGMCC No. 5913、CGMCC No. 5914。圖1為依據(jù)16S rDNA序列構(gòu)建的產(chǎn)脲酶菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

2.2 菌株培養(yǎng)及脲酶活性測定結(jié)果

配制發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母提取物10～20 g/L，硫酸銨或氯化銨10 g/L，pH 7.0～9.5，將100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基裝入500 mL培養(yǎng)瓶中滅菌，分別從平板中挑取單個菌落Sporosarcina pasteurii、Terrabacter tumescens、Sporosarcina antarctica UR53、Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp. UR31以及Bacillus lentus UR41分別接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37 ℃溫度下培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速為150～250 r/min。培養(yǎng)16 h后收集菌液，檢測6種菌液的生物量（用OD600 nm表示）和脲酶活性，檢測結(jié)果如圖2所示。

2.3 重金屬的固化試驗結(jié)果

分別取6種菌液1 mL，加入等體積0.5 mol/L的尿素溶液制成混合溶液，每種菌液制備6個平行樣，再將體積為2 mL的混合溶液分別加入到體積為0.5 mL，濃度為2 g/L的重金屬溶液NiCl2、CuCl2、PbCl2、CoCl2、ZnCl2以及CdCl2中，結(jié)果表明，所有產(chǎn)脲酶菌株對以上6種重金屬的固化去除率都在88%以上，UR47對銅和鉛的固化去除率最高，UR31對鈷和鋅的固化去除率最高，Terrabacter tumescens對鎳和鎘的固化去除率最高，結(jié)果如圖3所示。

在試驗中還取Sporosarcina koreensis UR47、Sporosarcina sp.UR31、Terrabacter tumescens菌液分別加入不同濃度的尿素溶液中，菌液體積與尿素溶液體積比分別為1∶1、1∶10、1∶20，使尿素終濃度為0.25 mol/L，取含尿素溶液的Sporosarcina koreensis UR47溶液的兩個試樣，分別加入濃度為0.5 g/L的銅溶液，濃度為5 g/L的鉛溶液，兩個試樣分別與銅溶液和鉛溶液的體積比為1∶10和1∶100；取含尿素溶液的Sporosarcina sp.UR31溶液的兩個試樣，分別加入鈷和鋅溶液，取含尿素溶液的Terrabacter tumescens溶液的兩個試樣，分別加入鎳和鎘溶液，重金屬溶液的濃度和體積比與Sporosarcina koreensis UR47相同。結(jié)果表明在不同的菌液、重金屬離子濃度條件下，重金屬離子的固化比例都在88%以上。

3 結(jié)論

結(jié)果表明，重金屬污染物，包括鎳、鈷、銅、鉛、鋅和鎘可以被細(xì)菌脲酶催化反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。從土壤中分離了大量脲酶產(chǎn)生菌，并對其進(jìn)行鑒定，同時對原位沉淀不同的重金屬污染物的能力進(jìn)行了分析，不同脲酶活性的細(xì)菌對重金屬離子的固化效果雖有所不同，但固化效率在88%以上。這種方法在處理重金屬污染廢水和沙質(zhì)土壤方面有著巨大的應(yīng)用前景。

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