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    生姜拮抗性內(nèi)生細菌的篩選

    2013-12-31 00:00:00袁建軍
    科技資訊 2013年12期

    摘 要:從樂山市售生姜根狀莖中分離純化內(nèi)生細菌,并以金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌 (Escherichia coli (E.coli))、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)為靶標菌進行抑菌試驗。研究結(jié)果表明:生姜中存在大量的內(nèi)生細菌,分離獲得的9個菌株對四種靶標菌都有不同程度的抑菌作用,2個菌株(SJ1 and SJ9)抑菌效果非常顯著,相對抑菌率超過170%。

    關鍵詞:生姜 內(nèi)生細菌 分離 拮抗作用 篩選

    中圖分類號:S476 文獻標識碼:A 文章編號:1672-3791(2013)04(c)-0154-03

    生姜(Zingiber officinale Roscoe)在中藥中是一種很重要的藥用植物,由于其性辛辣的特點,有發(fā)汗、驅(qū)寒、止嘔、解毒等多種功能[1],生姜中的一些代謝產(chǎn)物還具有良好的降膽固醇、抑菌、抗衰老、抗癌、防血凝、抗氧化及防腐等作用,如姜黃、姜精油[2]。生姜內(nèi)生細菌是指存在于生姜組織和器官內(nèi)部的細菌,根據(jù)相似相溶原理,生姜內(nèi)生細菌可能具有生姜相同的抑菌效果[3],可作為重要的天然抑菌材料來源進行研究。

    由于生姜的病變很少,本研究基于生姜內(nèi)生細菌可能具有抑菌功效的思想,從生姜組織中分離純化內(nèi)生細菌,并篩選對金黃色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大腸桿菌 (Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Methicillin-resistant staphylococcus aureus,MRSA)有抑菌作用的菌株,為利用植物內(nèi)生細菌資源開發(fā)抑菌新藥物提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    從樂山各市場購買市售食用生姜。

    1.2 靶標菌

    S.aureus、E.coli、B.subtilis、MRSA,由本校病理實驗室提供。

    1.3 培養(yǎng)基

    馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(分離純化培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g,葡萄糖5 g,瓊脂粉16 g,純凈水1000 ml,pH自然[4]。

    馬鈴薯瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(拮抗篩選培養(yǎng)基):馬鈴薯200 g,削皮煮汁,葡萄糖5 g,瓊脂粉20 g,水1000 ml,pH7.0[5]。

    1.4 生姜內(nèi)生菌的分離純化

    生姜的表面消毒:取無病無霉變的完整生姜塊根(約30 g),用自來水沖洗5 min,沖洗表面的泥土等污物,放于已滅菌的培養(yǎng)皿中,無菌水反復沖洗3~5次,5%次氯酸鈉洗滌3次,無菌水沖洗3~5次,收集最后一次沖洗液做無菌檢驗[6]。

    分離純化:在無菌條件下,分別用滅菌后的解剖刀切割表面消毒完全的生姜塊根成直徑為0.5 cm方形的小塊,用無菌鑷子將姜塊放于馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基上不同的地方,每個平板均勻擺放3~4塊,置于28 ℃培養(yǎng),每隔12 h觀察一次,培養(yǎng)2~3 d時間。待培養(yǎng)皿上出現(xiàn)單菌落時,根據(jù)菌落的形態(tài)、顏色、大小將其分類后采用平板劃線法接種到新鮮平板上培養(yǎng),直到獲得單菌落為止[7~8],純化后的菌株保存于斜面中備用。

    1.5 平板對峙法初篩

    內(nèi)生細菌活化后涂布接種在平板上培養(yǎng)24 h后,在無菌條件下用0.5 cm打孔器制打成菌餅[9~10],將菌餅放置于涂布接種有四種靶標菌的平板上,28 ℃培養(yǎng),每隔12 h觀察一次,培養(yǎng)48 h后用十字交叉法測定抑菌圈的大小[11~12],每處理重復三次,以無菌的培養(yǎng)基打孔代替菌餅做為對照(CK)[13]。相對抑菌率(%)=(抑菌圈直徑-菌餅直徑)/菌餅直徑×100%。

    1.6 牛津杯法復篩

    直接垂直插上已滅菌的牛津杯,輕輕加壓(注意不能與培養(yǎng)皿底部接觸)[14],使其與培養(yǎng)基接觸無空隙,每個平板插4個牛津杯,將初篩中有拮抗活性的菌株菌懸液100 ul加入到牛津杯中,置28 ℃培養(yǎng)48 h[15],十字交叉法測量抑菌圈直徑大小,記錄數(shù)據(jù)。每種處理重復三次,以向牛津杯中加入100 ul的無菌水代替菌懸液做為對照(CK)。相對抑菌率(%)=(抑菌圈直徑-菌餅直徑)/菌餅直徑×100%。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 生姜內(nèi)生細菌的分離純化

    通過反復分離純化,并按照菌落、菌株形態(tài)、大小、顏色等特征進行區(qū)分,共獲得9株可培養(yǎng)的內(nèi)生細菌,依次編號為SJ1-SJ9。

    2.2 拮抗菌株的初篩

    對分離純化得到的9株生姜內(nèi)生菌菌株進行了皿內(nèi)對峙法拮抗試驗,9個菌株均具有不同程度的抑菌效果,其中有7個菌株對四種病原細菌的抑菌圈直徑均大于12.5mm,相對抑菌率均超過150%(如表1)。

    2.3 拮抗功能菌株得復篩

    對初篩得到的7個菌株進行牛津杯法復篩,結(jié)果表明7個菌株對四種病原細菌都有不同程度的抑菌效果,其中SJ1和SJ9的抑菌效果比較明顯,對四種病原細菌的抑菌圈直徑超過13 mm,相對抑菌率超過170%(表2)。

    3 結(jié)論與討論

    (1)因生姜內(nèi)生細菌大多數(shù)具有抑菌作用,其中SJA和SJI抑菌圈的直徑大于等于13.7 mm,具有較強的抑菌效果。在初篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈大小依次為:13.8 mm、14.5 mm、13.7 mm、13.3 mm。在復篩過程中SJA對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為:13.7 mm、13.7 mm、13.7 mm、13.8 mm。在初篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為:13.1 mm、12.7 mm、13.4 mm、13.2 mm。在復篩過程中SJI對大腸桿菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌抑菌圈的大小依次為13.7 mm、13.8 mm、13.8 mm、13.6 mm。

    (2)本試驗中,判斷抑菌作用強弱的是抑菌圈的大小,此方法具有一定的局限性,通常只能定性判斷內(nèi)生細菌對靶標菌有無抑菌效果,不能確定內(nèi)生細菌抑菌的機制。

    (3)生姜內(nèi)生細菌大多數(shù)具有很強的抑菌效果[16],在醫(yī)學方面新藥的研發(fā)具有很高的研究價值,是一種重要的天然來源。

    (4)本試驗只是對生姜莖的內(nèi)生細菌進行了分離和篩選,而葉等器官沒有進行內(nèi)生細菌的分離和篩選,還等進一步進行研究。

    (5)本次試驗中,SJ1和SJ9初篩和復篩過程中抑菌圈大小存在差異,二者之間是否存在一定的聯(lián)系還不確定。

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