鈣網(wǎng)蛋白的結(jié)構(gòu)、功能與進(jìn)化

摘 要：鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）是一種滯留于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的可溶性Ca2+結(jié)合蛋白，有N-、P-、C-三個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，具有分子伴侶和調(diào)節(jié)Ca2+的穩(wěn)態(tài)等多種生物學(xué)功能。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，CRT對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別和清除發(fā)揮重要作用。同源性分析表明CRT的進(jìn)化高度保守。本文簡(jiǎn)要概述了CRT的結(jié)構(gòu)、功能及進(jìn)化的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：鈣網(wǎng)蛋白 生物學(xué)功能 細(xì)胞凋亡 進(jìn)化

中圖分類號(hào)：Q9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1672-3791（2013）06（a）-0226-02

鈣網(wǎng)蛋白（Calreticulin，CRT）是由oswald和maclennan 1974年第一次分離得到，1989年smith和koch、fliegel等人分別通過分子克隆方法得到CRT的cDNA序列。自此，CRT在很多實(shí)驗(yàn)室得到廣泛研究。迄今為止，在脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和高等植物中均分離得到CRT的cDNA序列。而在酵母菌和原核生物中目前認(rèn)為不存在CRT基因。

1 CRT的組成和結(jié)構(gòu)

CRT是非肌肉細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的主要鈣結(jié)合蛋白，由單基因編碼，含有一個(gè)氨基末端信號(hào)肽序列和一個(gè)羧基末端內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列（KDEL）。這些特殊的氨基酸序列能夠確保CRT進(jìn)入和滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。序列預(yù)測(cè)表明，CRT有一個(gè)或多個(gè)非保守的N-連接型糖基化位點(diǎn)，N-末端功能域有三個(gè)保守的半胱氨酸殘基位點(diǎn)，其中的兩個(gè)半胱氨酸殘基形成二硫鍵（C120-C146），這對(duì)CRT氨基末端區(qū)域的正確折疊可能很重要。

CRT有三個(gè)結(jié)構(gòu)功能域，N-功能域、P-功能域和C-功能域（圖1）。CRT的N-末端區(qū)域是一個(gè)高度折疊的球狀結(jié)構(gòu)，包含8個(gè)反向平行的β束連接著蛋白形成的環(huán)形結(jié)構(gòu)，氨基酸序列非常保守，有4個(gè)組氨酸殘基，能結(jié)合鋅離子Zn2+。P-功能域有一個(gè)富含脯氨酸的序列，由兩個(gè)三次重復(fù)的氨基酸序列PXXIXDPDAXKPEDWDE和GXWXPPXIXNPXYX 組成，這兩個(gè)重復(fù)序列對(duì)CRT凝集素樣分子伴侶的功能至關(guān)重要。P-功能域?qū)τ贑a2+有高的親和力。C-末端區(qū)域是高度酸性的，末端有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留序列KDEL。在CRT的C-功能域每摩爾CRT可以結(jié)合超過25mol Ca2+，Ca2+與C-功能域的結(jié)合在控制CRT與PDI、ERp57和可能的其它分子伴侶相互作用方面發(fā)揮調(diào)控作用。

圖1中小圓圈代表重復(fù)序列A（PxxIxDPDAxKPEDWDE），小方塊代表重復(fù)序列B（GxWxPPxIxNPxYx），KDEL為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)[1]。

2 CRT的生物學(xué)功能和細(xì)胞凋亡

CRT在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞外有廣泛的功能。其中，Ca2+的穩(wěn)態(tài)和分子伴侶是CRT在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最重要的兩個(gè)功能，細(xì)胞粘附和基因表達(dá)調(diào)控似乎是CRT在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)以外的最重要的功能。CRT還有許多其它的功能，包括整合素調(diào)節(jié)、類固醇激素受體結(jié)合蛋白及自身免疫缺陷疾病等。作為分子伴侶，CRT可促進(jìn)蛋白正確折疊和裝配，招募其他折疊酶增加中間物正確折疊的比率。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔Ca2+濃度連續(xù)地變化時(shí)，CRT能夠維持Ca2+穩(wěn)態(tài)。CRT可利用它的分子伴侶和凝集素樣功能調(diào)控Ca2+流動(dòng)穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜[2]。CRT與其他伴侶和未成熟多糖的相互作用依賴于Ca2+的存在。CRT參與調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附、整合素依賴的Ca2+信號(hào)、類固醇敏感基因表達(dá)和T淋巴細(xì)胞活化，無(wú)論在體內(nèi)還是體外實(shí)驗(yàn)都已被證明。在CRT的研究領(lǐng)域一個(gè)主要的爭(zhēng)論是關(guān)于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外CRT依賴的調(diào)節(jié)功能的機(jī)制。CRT參與調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附作用可能與調(diào)節(jié)鈣粘連素基因表達(dá)、紐帶蛋白、改變酪氨酸激酶和蛋白磷酸酶活性有關(guān)[3]。

近來(lái)研究表明，CRT在機(jī)體對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別和清除中發(fā)揮重要作用。細(xì)胞經(jīng)歷凋亡會(huì)使細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，在預(yù)凋亡的刺激下，CRT會(huì)暴露于細(xì)胞表面，作為一個(gè)免疫原性細(xì)胞死亡（ICD）信號(hào)，與二硫化物異構(gòu)酶ERp57共同扮演了“吃我”的信號(hào)[4]，誘導(dǎo)吞噬細(xì)胞識(shí)別和清除凋亡細(xì)胞。

3 CRT的進(jìn)化

CRT在脊椎動(dòng)物、無(wú)脊椎動(dòng)物和高等植物中廣泛存在，關(guān)于CRT分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)生理和病理作用已有很多的研究，但是關(guān)于進(jìn)化的報(bào)道較少。Kales等進(jìn)化樹分析顯示，硬骨魚CRT序列高度聚集在一起，哺乳動(dòng)物和植物CRT分別獨(dú)立聚集為一枝。ilerová等報(bào)道發(fā)現(xiàn)蚯蚓CRT與已知序列的無(wú)脊椎動(dòng)物CRT具有很高的同源性（65%～75%）。

我們選取了在進(jìn)化地位上有代表性的物種的CRT序列，包括人、猴、鼠、雞、爪蟾、河豚、斑馬魚、文昌魚、海鞘、海膽和線蟲，分析了CRT在無(wú)脊椎動(dòng)物和脊椎動(dòng)物中的進(jìn)化情況。CRT基因結(jié)構(gòu)比較顯示，從無(wú)脊椎動(dòng)物到原索動(dòng)物，編碼外顯子出現(xiàn)了不同程度的合并和拆分現(xiàn)象。線蟲有3個(gè)編碼外顯子，2個(gè)內(nèi)含子，海膽有8個(gè)編碼外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，兩者同源性為67.2%。海膽與被囊動(dòng)物海鞘均有8個(gè)外顯子，7個(gè)內(nèi)含子，同源性為64.2%，內(nèi)含子的插入位置和內(nèi)含子類型有很大不同。海膽缺失了對(duì)應(yīng)于高等動(dòng)物中4號(hào)外顯子位置的編碼外顯子，內(nèi)含子長(zhǎng)度大量增加，8號(hào)外顯子長(zhǎng)度明顯增加，內(nèi)含子類型發(fā)生變化，內(nèi)含子的插入位置與高等動(dòng)物有較大差別。海膽5號(hào)和6號(hào)外顯子與高等動(dòng)物的相應(yīng)外顯子對(duì)應(yīng)，但在海鞘中合并為一個(gè)外顯子，作為尾索動(dòng)物的海鞘基因結(jié)構(gòu)與高等物種有較大的差別，突出了海鞘在進(jìn)化中的特殊地位。從文昌魚開始，CRT在物種中的進(jìn)化已經(jīng)變得很保守，與高等動(dòng)物一樣都有9個(gè)編碼外顯子，8個(gè)內(nèi)含子。綜上所述，從整個(gè)基因結(jié)構(gòu)看，無(wú)脊椎動(dòng)物及尾索動(dòng)物的基因結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定；而頭索動(dòng)物文昌魚和脊椎動(dòng)物的基因結(jié)構(gòu)則相對(duì)穩(wěn)定，從無(wú)脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物，基因有變長(zhǎng)的趨勢(shì)，內(nèi)含子數(shù)目增加，基因結(jié)構(gòu)變得復(fù)雜，符合生物進(jìn)化一般規(guī)律。

多序列比對(duì)表明不同物種的CRT編碼序列N端都具有信號(hào)肽，有兩個(gè)典型的的鈣結(jié)合蛋白家族特征序列KHEQKIDCGGGYI和IMFGPDICG，P-功能域有兩個(gè)三倍重復(fù)序列以及C末端的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號(hào)序列KDEL（R/HDEL）。另外，不同物種CRT序列同源性均大于60%，小于等于98.3%，顯著地表明了CRT進(jìn)化的高度保守性。

4 結(jié)語(yǔ)

CRT是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中主要的鈣結(jié)合蛋白，存在于高等生物除紅細(xì)胞之外的所有細(xì)胞中，具有分子伴侶、調(diào)節(jié)Ca2+的穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞粘附和基因表達(dá)調(diào)控等多種生物學(xué)功能，另外，對(duì)凋亡細(xì)胞的識(shí)別和清除起著關(guān)鍵性的作用，具有高度的進(jìn)化保守性。

迄今為止，有關(guān)CRT的分子結(jié)構(gòu)及相關(guān)生理和病理功能有大量的研究，CRT的過量表達(dá)或者缺失與一系列的病理?xiàng)l件相關(guān)聯(lián)，如惡性腫瘤的演化和進(jìn)展。研究表明，CRT過表達(dá)在許多癌癥中是一個(gè)促癌事件，但作用機(jī)制仍不明確，將來(lái)應(yīng)該集中解釋惡化前和侵入前CRT的影響以及確定可能的相關(guān)聯(lián)的基因和信號(hào)途徑的機(jī)制[5]。鑒于CRT在多種細(xì)胞過程和信號(hào)途徑的復(fù)雜作用，CRT很可能成為腫瘤治療的新的靶點(diǎn)。

參考文獻(xiàn)

[1]吳紅艷，王艷林.鈣網(wǎng)蛋白與腫瘤免疫[J].生命科學(xué)，2011（23）：1009-13.

[2]John LM，Lechleiter JD，Camacho P.Differential modulation of SERCA2 isoforms by calreticulin.The Journal of cell biology，1998（142）：963-73.

[3]Fadel MP，Szewczenko-Pawlikowski M， Leclerc P，Dziak E，Symonds JM， Blaschuk O，et al.Calreticulin affects beta-catenin-associated pathways.The Journal of biological chemistry，2001（276）：27083-9.

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[5]Zamanian M，Veerakumarasivam A， Abdullah S，Rosli R.Calreticulin and Cancer.Pathology oncology research：POR，2013.