滇楊側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)表達(dá)基因多樣性的cDNA-AFLP分析

李 里 ，江 濤 ,b，吳 海 ，周安佩 ，王濱蔚 ，劉東玉 ，何承忠 ,b

（西南林業(yè)大學(xué) a.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

滇楊側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)表達(dá)基因多樣性的cDNA-AFLP分析

李 里a，江 濤a,b，吳 海a，周安佩a，王濱蔚a，劉東玉a，何承忠a,b

（西南林業(yè)大學(xué) a.西南山地森林資源保育與利用省部共建教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；b.西南地區(qū)生物多樣性保育國家林業(yè)局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

為探討滇楊分枝特性差異的分子機(jī)理，以采集于四川省和云南省的59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系3a苗木為研究對象，采用cDNA-AFLP技術(shù)，分析苗木側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)表達(dá)基因的多樣性。研究結(jié)果顯示，篩選出的7對引物組合共擴(kuò)增出了577條帶，其中差異性條帶數(shù)為318條，差異性條帶比率為55.11%，Nei’s基因多樣性指數(shù)為0.097 8，Shannon信息指數(shù)為0.172 1，基因分化系數(shù)為0.016 7，居群間的基因流為29.42，表明居群間的遺傳分化程度較低。AMOVA分析顯示，居群間的差異占2.13%，居群內(nèi)差異占97.87%，且居群間和居群內(nèi)均差異極顯著。表明滇楊側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)基因表達(dá)較復(fù)雜，使進(jìn)一步開展分枝相關(guān)基因的研究工作難度較大。聚類分析結(jié)果顯示，在亞分枝單元或最小分枝單元，無性系能夠以分枝性狀相聚，說明應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行滇楊分枝性狀相關(guān)基因的定位、分離及鑒定是可行的。

滇楊側(cè)芽；萌動(dòng)期；表達(dá)基因的多樣性；轉(zhuǎn)錄組差異；cDNA-AFLP分析

滇楊Populus yunnanensis Dode是我國西南地區(qū)特有鄉(xiāng)土楊屬青楊派樹種之一，主要分布在云南省滇中、滇西北、滇東北地區(qū)，四川省涼山州、貴州威寧縣等與云南省相鄰地區(qū)也有分布，屬于全國乃至世界少有的廣泛分布于低緯度高海拔地區(qū)的寶貴楊樹資源，也是開展山地造林的良好樹種[1-4]。Hamilton等通過光學(xué)顯微鏡和分光光度計(jì)檢測滇楊花粉發(fā)現(xiàn)，滇楊具有比前期預(yù)想更普遍的大量三核花粉，其中一個(gè)為營養(yǎng)核，兩個(gè)為生殖核，三核花粉對楊樹雜交育種具有非常重要的意義[5]。Sharma和Sanjeeve對滇楊抗病和抗蛀干害蟲的研究表明，滇楊對葉銹病和葉斑病具有較強(qiáng)的抗性，但對蛀干害蟲的抗性較弱，其主干與較大側(cè)枝易遭天牛為害[6]。但栽種于不同地區(qū)的滇楊遭受蛀干害蟲為害狀況有差異，如被引種到貴州黔中地區(qū)的滇楊天牛為害率達(dá)到70%以上，而分布在貴州威寧縣的滇楊則很少受害[7]。何承忠等在滇楊資源調(diào)查中也發(fā)現(xiàn)，分布于海拔2 200 m左右地區(qū)的滇楊生長較通直，且較少受天牛為害，而生長于海拔1 900 m左右地區(qū)的滇楊則受天牛為害較嚴(yán)重[8]。此外，滇楊比其它楊屬樹種的光合作用和組織活動(dòng)能力強(qiáng)，促使其生長迅速[9]；芽具有鱗片，并附著較多芽脂，春季萌發(fā)較遲，因此，抗寒能力較強(qiáng)，避開了早春倒春寒的為害[8]。由此可見，滇楊的開發(fā)利用，不僅能夠?yàn)槲覈鴹顦溆N提供新的基因資源，還能夠?yàn)槲覈咴貐^(qū)短周期速生豐產(chǎn)林的營造提供一個(gè)好的樹種。

然而，滇楊主干和各級齡級的枝條產(chǎn)生不定芽的能力極強(qiáng)，這種萌生能力保證了在截去大的側(cè)枝，甚至截去整個(gè)樹冠后仍能萌芽，使其能夠適應(yīng)不同程度的修剪[10]，同時(shí)，也使滇楊樹體分枝數(shù)量較多，極大地影響了其高生長、干形通直度及木材的可加工性和利用價(jià)值[8]。在優(yōu)樹收集過程中發(fā)現(xiàn)，滇楊的側(cè)枝粗細(xì)、數(shù)量多少、分枝角大小等分枝性狀變異較為豐富，為開展該樹種理想株型的選擇育種、分枝調(diào)控分子機(jī)理研究等儲備了基礎(chǔ)材料。為此，本研究采用cDNA-AFLP分子標(biāo)記技術(shù)，分析滇楊優(yōu)樹無性系3 a 苗木主干側(cè)芽在萌動(dòng)時(shí)表達(dá)基因的多樣性，為深入開展調(diào)控滇楊分枝性狀的相關(guān)功能基因篩選、定位、分離及鑒定等工作的研究方案制定、材料選取提供科學(xué)依據(jù)，也為開展滇楊理想株型分子輔助育種奠定前期研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

采用絕對值優(yōu)樹選擇方法，于2008年12月至2009年2月從四川省涼山州、云南省麗江市、曲靖市等滇楊天然林或人工林中，選擇基本處于自然生長狀態(tài)、人為干擾較少、生長健壯、干形通直圓滿、無病蟲害的成年優(yōu)樹59株，分別采集當(dāng)年萌生的健壯枝條作為繁殖材料，制作約20 cm長的插穗進(jìn)行扦插繁殖育苗。采用完全區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)，4株小區(qū)，3次重復(fù)，于次年3月平茬后以株行距3 m × 3 m定植于西南林業(yè)大學(xué)樹木園。于2012年3月側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)，在同一區(qū)組內(nèi)，各優(yōu)樹無性系在小區(qū)內(nèi)隨機(jī)選取1株苗木，采取上一年度抽生主干的中下部3顆側(cè)芽混合后作為測試樣本，提取總RNA。59株滇楊優(yōu)樹來源詳見表1。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA提取與cDNA雙鏈合成

將側(cè)芽置于預(yù)先冷凍的研缽內(nèi)，加入適量液氮后輕輕敲擊，去除芽鱗，采用改良CTAB法提取各樣本的總RNA[11]。參照TIANGEN公司Quant cDNA Synthesis Kit中介紹的方法合成cDNA第一條鏈。第二條鏈合成每管反應(yīng)體系80 μL，其中，F(xiàn)irst Strand reaction mixture 20 μL，10×E.coli DNA ligase buffer 8 μL，10 mM dNTP mix 1.5 μL，0.1M DTT 3.0 μL，E.coli DNA ligase（60 u/μL）0.125μL，DNA polymerse I（5 U/μL）5 μL，RNase H（5U/μL）0.015 μL，加ddH2O至80 μL。12℃溫育2 h后，22℃溫育2 h；加入17 μL 0.2 mol EDTA，終止反應(yīng)；加入 1.5 μL（15U）RNAase，37℃消化 30 min；加入5 μL（3U）的蛋白酶K，37 ℃消化30 min。雙鏈cDNA合成后經(jīng)過純化，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 cDNA-AFLP分析

采用EcoR I/ Pst I組合進(jìn)行cDNA的限制性雙酶切，與接頭連接，預(yù)擴(kuò)增反應(yīng)選用引物組合E00/P00，選擇性擴(kuò)增反應(yīng)采用E+3/ P+3引物組合，選擇性擴(kuò)增產(chǎn)物在6%變性聚丙烯酰胺凝膠上電泳分離，銀染法進(jìn)行指紋圖譜的顯影。

1.2.3 譜帶統(tǒng)計(jì)與分析

依據(jù)同一位點(diǎn)條帶的“有”、“無”，分別計(jì)為“1”或“0”，形成0/1矩陣。應(yīng)用POPGENE 1.32軟件對云南和四川2個(gè)滇楊居群及各單株滇楊優(yōu)樹無性系分別進(jìn)行各參數(shù)分析，計(jì)算差異性條帶百分率（PPB）、觀測等位基因數(shù)（No）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）、Shannon信息指數(shù)（I）和居群間基因分化系數(shù)（GST）[12]。應(yīng)用NTSYSpc 2.0軟件計(jì)算各優(yōu)樹間的遺傳相似系數(shù)，采用UPGMA方法對各優(yōu)樹無性系進(jìn)行聚類分析。

表1 59株滇楊優(yōu)樹采集地點(diǎn)及分枝性狀Table 1 Sample site and branch characteristics of 59 plus trees of P. yunnanensis

2 結(jié)果與分析

2.1 59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系之間的差異表達(dá)基因多樣性

篩選出的7對引物組合對2個(gè)居群共計(jì)59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)cDNA-AFLP擴(kuò)增分析，共獲得577條擴(kuò)增條帶，每對引物組合平均得到82.4條擴(kuò)增條帶，其中318條擴(kuò)增條帶為差異性條帶，占總擴(kuò)增條帶數(shù)的55.11%。59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系檢測出觀測等位基因數(shù)（No）為1.524 3，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.125 4，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.097 8，Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.172 1（表2），基因表達(dá)總差異HT為0.095 4，個(gè)體間平均基因表達(dá)差異HS為0.093 8。由此可知，在萌動(dòng)時(shí)，不同滇楊優(yōu)樹無性系側(cè)芽內(nèi)功能基因的表達(dá)差異性較為豐富而復(fù)雜。

表2 滇楊優(yōu)樹無性系側(cè)芽cDNA-AFLP分析結(jié)果Table 2 Results of plus tree clones of P. yunnanensis by cDNA-AFLP

2.2 滇楊2個(gè)居群之間的差異表達(dá)基因多樣性

由表2可見，7對引物組合對云南居群23個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系擴(kuò)增得到差異性條帶為287條，占總擴(kuò)增條帶577條的49.74%，檢測出的觀測等位基因數(shù)（No）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）和Shannon’s信息指數(shù)（I）分別為1.497 4、1.110 9、0.082 4和0.145 1；而四川居群36個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系擴(kuò)增得到差異性條帶為318條，占總帶數(shù)的55.11%，檢測出的觀測等位基因數(shù)（No）為1.551 1，有效等位基因數(shù)（Ne）為1.139 9，Nei’s基因多樣性指數(shù)（H）為0.105 2，Shannon’s信息指數(shù)（I）為0.182 2。四川居群的各指標(biāo)均高于云南居群，而居群之間的基因分化系數(shù)Gst=0.016 7，基因流Nm=29.42，表明滇楊2個(gè)居群之間具有較高的基因交流，遺傳分化不明顯，僅有1.67%的差異存在于不同居群之間，而主要差異來源于居群內(nèi)不同個(gè)體之間。

分子方差分析（AMOVA）結(jié)果表明（表3），居群之間的變異方差分量為0.994 6，占總變異的2.13%，居群內(nèi)不同個(gè)體之間的方差分量為45.630 9，占總變異的97.87%。經(jīng)過1 000次隨機(jī)模擬檢測，滇楊居群之間與居群內(nèi)不同個(gè)體之間均存在著極顯著差異。

2.3 聚類分析

基于cDNA-AFLP分析結(jié)果，應(yīng)用NTSYSpc version 2.10e軟件計(jì)算59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系間在側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)的基因表達(dá)相似系數(shù)并采用UPGMA進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系之間的基因表達(dá)相似系數(shù)在0.738～0.976之間，平均基因表達(dá)相似系數(shù)為0.840，云南居群23個(gè)個(gè)體之間平均基因表達(dá)相似系數(shù)為0.865，四川居群36個(gè)個(gè)體之間平均基因表達(dá)相似系數(shù)為0.828。其中，無性系QXJ016和QXJ018之間的基因表達(dá)相似系數(shù)最大，為0.976，表明二者之間的基因表達(dá)差異性最小；無性系LMB029和LMB033之間、無性系LMB028和LMB034之間的遺傳相似系數(shù)最小，均為0.738，表明兩者之間的基因表達(dá)差異性最大。

表3 滇楊2個(gè)居群cDNA-AFLP標(biāo)記的AMOVA分析Table 3 AMOVA analysis of cDNA-AFLP markers between two populations of P. yunnanensis

以相似系數(shù)0.80為閾值，59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系聚分為3組（圖1）。第1組由43個(gè)無性系構(gòu)成，來自于四川居群的無性系有24個(gè)，云南居群無性系有19個(gè)；第2組共包含了14個(gè)無性系，四川居群無性系有10個(gè)，4個(gè)無性系來自于云南居群；第3組僅有2個(gè)無性系，均來自于四川居群。由此可知，基于側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)基因表達(dá)相似系數(shù)的聚類關(guān)系與無性系采集地之間沒有直接相關(guān)性，也沒有按分枝特性的差異聚分為不同類群。然而，進(jìn)一步對亞分枝單元和最小分枝單元分析可知，大部分無性系能夠以側(cè)枝粗細(xì)或側(cè)枝多少相聚為亞分枝單元或最小分枝單元，而分枝角的大小無規(guī)律可循。如無性系QXJ022、QXJ021和QXB028，分枝角分別為小、大和近平展，側(cè)枝分枝數(shù)量均較多且粗大，3個(gè)無性系相聚為一個(gè)亞分枝單元；無性系QXB026、LMB007和LMB022，分枝角分別為大、小和小，側(cè)枝分枝數(shù)分別為少、多和多，而側(cè)枝粗度均較細(xì)，三者相聚為一個(gè)亞分枝單元。但也有分枝性狀完全不同而相聚為一個(gè)分枝單元的結(jié)果，如無性系QZY002和LMB018，分枝角、側(cè)枝數(shù)量和粗度3個(gè)性狀均相差明顯，但該2個(gè)無性系同處于一個(gè)分枝單元。

圖1 基于相似系數(shù)構(gòu)建的UPGMA聚類Fig. 1 Dendrogram generated by UPGMA based on similarity coefficients

3 結(jié)論與討論

cDNA-AFLP技術(shù)是Bechem等將AFLP技術(shù)應(yīng)用于mRNA表達(dá)差異分析而形成的一種mRNA指紋圖譜技術(shù)[13]，具有重復(fù)性好、穩(wěn)定、可靠的特點(diǎn)，可對生物體轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行全面、系統(tǒng)的分析[14]。因此，cDNA-AFLP差異顯示方法是鑒定未知基因的有效手段之一[15]，特別適合差異表達(dá)基因的分離，也是分離組織特異性和發(fā)育階段特異性基因的快速、可靠的方法[14,16]。Carmona等應(yīng)用cDNA-AFLP技術(shù)分析了黑頂柄銹病浸染甘蔗時(shí)應(yīng)答基因表達(dá)的差異性，獲得了34個(gè)包含基因表達(dá)信息的TDFs，并對其功能進(jìn)行了分析[17]。劉雪梅等對白樺雄花突變體早期發(fā)育差異表達(dá)基因進(jìn)行了cDNA-AFLP分析，共獲得81個(gè)TDFs，其中51個(gè)TDFs為新基因，30個(gè)TDFs與已知蛋白具有較高同源性[18]。申艷紅等利用cDNA-AFLP技術(shù)對破色期和半黃期的番木瓜果實(shí)進(jìn)行了基因差異表達(dá)分析，獲得了50個(gè)與果實(shí)成熟相關(guān)的差異基因片段，其中28個(gè)與GenBank數(shù)據(jù)庫中的功能基因同源[19]。本研究采用cDNA-AFLP技術(shù)對采集于云南省23個(gè)優(yōu)樹無性系和四川省36個(gè)優(yōu)樹無性系在萌動(dòng)時(shí)側(cè)芽轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了分析，篩選出的7對引物組合共擴(kuò)增得到577條帶，其中獲得差異基因片段318條，占總帶數(shù)的55.11%，表明在萌動(dòng)時(shí)參與調(diào)控滇楊側(cè)芽內(nèi)分生組織活動(dòng)的基因數(shù)量較多。該結(jié)果與植物分枝相關(guān)的分生組織發(fā)育形成及生長是通過激素和轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)相互作用而得到控制，是由多個(gè)基因、多相基因家族共同參與調(diào)節(jié)分枝的形成與生長的研究結(jié)果相一致[20-21]。

作為合成cDNA模板的mRNA，不僅具有時(shí)空表達(dá)的特異性，而且還對環(huán)境條件較為敏感，在試驗(yàn)中控制條件缺少一致性，也將導(dǎo)致差異性增加，影響結(jié)果的可靠性。本試驗(yàn)中采用的滇楊優(yōu)樹無性系材料，栽植于相同環(huán)境條件之下，所采集的側(cè)芽處于苗木的相同位置，消除了時(shí)空效應(yīng)和環(huán)境效應(yīng)對基因表達(dá)的影響。因此，cDNAAFLP技術(shù)檢測到的滇楊優(yōu)樹無性系萌動(dòng)時(shí)側(cè)芽基因表達(dá)的差異性，是滇楊不同無性系遺傳基礎(chǔ)差異導(dǎo)致的結(jié)果，也表明滇楊具有較高水平的遺傳多樣性。

滇楊優(yōu)樹無性系側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)基因表達(dá)的差異性，可能還反映在不同個(gè)體在物候方面的不同表現(xiàn)。王德新等對本試驗(yàn)59個(gè)無性系中的41個(gè)無性系物候進(jìn)行了觀測[22]。結(jié)果表明，滇楊41個(gè)優(yōu)樹無性系可以劃分總體物候出現(xiàn)較晚類型，總體物候出現(xiàn)較早類型，生長期較短類型，生長期較長類型和中間型物候類型共計(jì)5種物候類型。在觀測的5種物候指標(biāo)中，萌芽期的差異最大，變異系數(shù)達(dá)到10.8%。由此可見，滇楊不同無性系之間存在著較為明顯的物候期不一致性，而這種不一致性在本質(zhì)上是由遺傳基礎(chǔ)差異性所決定的，但也為開展分枝相關(guān)基因的篩選等研究工作中取材時(shí)間的確定增加了難度。

盡管在環(huán)境因素的影響下植物分枝具有一定的可塑性，但總體而言分枝發(fā)育調(diào)控是受遺傳因素控制的[23]，不同物種間具有的特異性分枝發(fā)育程序使其具有特異性外在表型[20]。研究結(jié)果表明，樹木的分枝特性受中度至較強(qiáng)的遺傳控制，特別在楊樹中，除分枝粗外，分枝角、分枝長、分枝數(shù)等性狀在不同基因型間存在明顯的差異[24-25]。本研究中，基于基因表達(dá)相似系數(shù)的聚類結(jié)果表明，以80.0%的相似性劃分，59個(gè)滇楊優(yōu)樹無性系既沒有以采集地聚為不同類群，也沒有以分枝性狀聚分為不同類型。但進(jìn)一步對亞分枝單元或最小分枝單元分析可以看出，大部分相同分枝性狀的無性系還是能夠分別聚集于較小分枝單元，但不同分枝性狀的無性系聚類分枝交互出現(xiàn)。表明cDNA-AFLP對滇楊優(yōu)樹無性系側(cè)芽萌動(dòng)時(shí)轉(zhuǎn)錄組的檢測結(jié)果，不僅能夠反映無性系在側(cè)枝性狀方面的差異，而且也反映出了無性系側(cè)芽其他性狀的差異。該結(jié)果為開展滇楊分枝相關(guān)基因篩選等工作的研究方案制定、試材的選取等提供了科學(xué)依據(jù)，同時(shí)也表明采用cDNA-AFLP技術(shù)進(jìn)行滇楊分枝相關(guān)基因的定位、分離和鑒定是可行的。

[1] 何承忠, 張志毅, 陳寶昆, 等. 滇楊遺傳改良策略初論[J]. 西部林業(yè)科學(xué), 2004, 33(1): 44-48.

[2] Chandra J P, Ram A. Trial on exotic poplars in Himachal Pradesh[J]. Van Vigyan, 1973, 11(1/2): 1-6.

[3] Burfal B S, Meena K L, Sharama R C, et al. Status of poplar in Uttar Pradesh[J]. India Forester, 2001, 127(2): 137-143.

[4] 李忠洪, 張洪清. 楊樹山地造林品種比較試驗(yàn)[J]. 貴州林業(yè)科技, 1995, 23(3): 17-19.

[5] Hamilton D, Langridge P. Trinucleate pollen in the genus Populus[J]. Experientia,, 1976, 32(4): 467-468.

[6] Sharma R C, Sanjeeve S. Reaction on poplar germplasm to Cladosporium leaf spot[J]. India Forester, 2001, 127(2): 160-162.

[7] 伍孝賢. 貴州楊樹資源調(diào)查研究[J]. 貴州農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào), 1994,13(2): 19-23.

[8] 何承忠, 車鵬燕, 周修濤, 等. 滇楊基因資源及其研究概況[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào), 2010, 30(1): 83-88.

[9] 徐緯英. 楊樹[M]. 哈爾濱: 黑龍江人民出版社, 1988.

[10] 袁金成. 滇楊營林造林及病蟲害防治技術(shù)[J]. 中國林業(yè),2004, 2: 40.

[11] 車鵬燕, 王濱蔚, 李 里, 等. 滇楊葉芽總RNA提取方法比較研究[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2012, 27(3): 396-400.

[12] Yeh F C, Yang R C, Boyle T. POPGENE version 1.32: Microsoft Windows-based freeware for population genetic analysis,quick user guide[M]. Canada: Center for International Forestry Research, University of Alberta, 1999.

[13] Becham C, Heven R S, Bruijn Z M, et al. Visualization of differential gene expression using a novel method of RNA fingerprinting based on AFLP: analysis of gene expression during potato tuber development[J]. Plant Journal, 1996, 9(6): 745-753.

[14] 韓 斌, 彭建營. cDNA-AFLP技術(shù)及其在植物基因表達(dá)研究中的應(yīng)用[J]. 西北植物學(xué)報(bào), 2006, 26(8): 1753-1758.

[15] Dellagi A, Brich P R J, Heilbronn J. cDNA-AFLP analysis of differential gene expression in the prokaryotic plant pathogen Erwinia carotovora[J]. Microbiology, 2000, 146(1): 165-171.

[16] Johnes J T, Rower H. A comparison the efficiency of differential display and cDNA-AFLP as a tools for the isolation of differentially expressed parasite genes[J]. Fundamental and Applied Nemadity, 1998, 21: 81-88.

[17] Carmona E, Vargas D, Borroto C J, et al. cDNA-AFLP analysis of differential gene expression during the interaction between sugarcane and Puccinia melanocephala[J]. Plant Breeding, 2004,123: 499-501.

[18] 劉雪梅, 劉 瀛, 宋福南, 等. 白樺雄花突變體早期發(fā)育差異表達(dá)基因的cDNA-AFLP分析[J]. 林業(yè)科學(xué),2012,48(5):20-28.

[19] 申艷紅, 陳曉靜, 盧秉國, 等. 番木瓜果實(shí)成熟相關(guān)基因的cDNA-AFLP分析及克隆[J]. 園藝學(xué)報(bào),2011,38(6):1081-1088.

[20] 鞏鵬濤, 李 迪. 植物分枝發(fā)育的遺傳控制[J]. 分子植物育種,2005, 3(2): 151-162.

[21] 史 俊, 楊鶴同. 植物分枝性狀遺傳機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 安徽農(nóng)學(xué)通報(bào), 2010, 16(24): 32-34.

[22] 王德新, 張 晏, 段安安, 等. 滇楊優(yōu)樹無性系物候期觀測[J]. 西南林學(xué)院學(xué)報(bào), 2009, 29(6): 20-23.

[23] Leyser O. Regulation of shoot branching by auxin[J]. Trends Plant Science, 2003, 8(11): 541-545.

[24] David A K. Tree allometry, leaf size and adult tree size in oldgrowth forests of western Oregon[J]. Tree Physiology, 1991, 9:369-381.

[25] Cline M G, Dongil K. A preliminary investigation of the role of Auxin and Cytokinin in sylleptic branching of three hybrid poplar clones exhibiting contrasting degrees of sylleptic branching[J].Annals of Botany, 2002, 90: 417-421.

Diversity analysis of expressing genes at lateral buds sprouting stage of Populus yunnanensis by cDNA-AFLP markers

LI Lia, JIANG Taoa,b, WU Haia, ZHOU An-peia, WANG Bin-weia, LIU Dong-yua, HE Cheng-zhonga,b
(a. Key Lab. for Forest Resources Conservation and Use in the Southwest Mountains of China; Ministry of Education, b. Key Lab.of Biodiversity Conservation in Southwest China, State Forestry Administration, Southwest Forestry University, Kunming 650224,Yunnan, China)

In order to reveal the molecular mechanism of branching characteristic differences in Populus yunnanensis, 59 three-yearold seedlings of plus trees clones of P. yunnanensis, were collected from Sichuan Province and Yunnan Province, and were used as the tested materials. The cDNA-AFLP molecular technique was conducted to examine expressing genes diversity at sprouting stage of lateral buds of the seedlings. The results show that by using the selected seven prime combinations, a total of 577 bands were amplified,of which 318 (55.11%) were different bands, the Nei’s gene diversity index and Shannon’s information index were 0.0978 and 0.1721,respectively, the coefficient of gene differentiation was 0.0167, and gene flow was 29.42, which indicated a lower genetic differentiation existed among populations of P. yunnanensis. The analysis of molecular variance (AMOVA) showed that the variance was 2.17%among populations and 97.87% within population. Moreover, the variance was significantly different among population and within population. The findings suggested that the gene expression was complex at sprouting stage of lateral buds, and it was difficult to analyze the candidate genes being related to branching. Furthermore, the clustering results showed that the clones held the same branching characteristics fell into sub-cluster unit or single cluster unit, which indicated that the cDNA-AFLP technique used to map, isolate and identify the candidate genes being related to branching was feasible.

lateral buds of Populus yunnanensis; sprouting stage; diversity of expressing genes; transcription differences; cDNA-AFLP

S792.11；S718.46

A

1673-923X(2013)09-0032-06

2012-10-16

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(30960320)；國家林業(yè)公益性行業(yè)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(201104076)；云南省中青年學(xué)術(shù)與技術(shù)帶頭人后備人才培養(yǎng)基金項(xiàng)目(2012HB021)

李 里（1985- ），男，云南德宏人，碩士研究生，主要從事林木遺傳育種研究

何承忠（1970- ），男，甘肅民勤人，博士，教授，主要從事林木遺傳育種與分子生物學(xué)方面的研究；

E-mail：hcz70@163.com

[本文編校：吳 毅]