氮添加對(duì)樟樹林紅壤微生物群落代謝功能的影響

郁培義，朱 凡，王志勇，閆文德，宿少鋒，李天平

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 南方林業(yè)應(yīng)用技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004)

氮添加對(duì)樟樹林紅壤微生物群落代謝功能的影響

郁培義1,2，朱 凡1,2，王志勇1,2，閆文德1,2，宿少鋒1,2，李天平1,2

(1. 中南林業(yè)科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖南 長沙 410004；2. 南方林業(yè)應(yīng)用技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004)

為探討氮添加對(duì)土壤微生物群落代謝功能多樣性的影響，采用BIOLOG AN、FF、GenIII 和 YT 4種微生物平板測定了氮添加不同水平樟樹林紅壤微生物的代謝活性及其多樣性。結(jié)果表明：(1)高濃度施氮對(duì)樟樹人工林土壤微生物厭氧菌的代謝功能具有促進(jìn)作用，而低濃度施氮抑制其活性。(2)氮添加不同水平處理均促進(jìn)土壤微生物革蘭氏好氧菌的活性，且施氮濃度越高促進(jìn)作用越明顯。(3)氮添加不同水平處理均抑制土壤微生物真菌和酵母菌活性。多樣性的研究結(jié)果也與土壤微生物代謝活性的變化相似。

氮添加；BIOLOG；微生物群落; 代謝功能；多樣性

土壤微生物作為森林土壤重要組成部分，在凋落物分解、養(yǎng)分循環(huán)和植物養(yǎng)分利用過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[1]。土壤微生物對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)敏感，是土壤環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。土壤微生物群落功能多樣性是土壤微生物群落狀態(tài)與功能的指標(biāo)，反映土壤中微生物的生態(tài)特征。1991年Garland等首次將BIOLOG微平板技術(shù)應(yīng)用于描述混合的微生物群體特征[3]。近十幾年來，BIOLOG技術(shù)在微生物生態(tài)及環(huán)境微生物檢測方面的應(yīng)用取得了長足進(jìn)步。BIOLOG主要是通過測定微生物對(duì)各類碳源利用程度的差異來反映土壤中微生物群落代謝功能的不同，此方法已廣泛應(yīng)用于評(píng)價(jià)土壤微生物群落的功能多樣性[4]。

氮素被認(rèn)為是陸地生態(tài)系統(tǒng)初級(jí)生產(chǎn)力的限制性養(yǎng)分元素，因此人類大量使用氮肥來增加土壤可利用性氮素的水平，促進(jìn)植物的生長。但是研究表明，外加氮輸入會(huì)增加土壤溶液的氮淋溶，導(dǎo)致土壤的進(jìn)一步酸化[5]。那么土壤微生物為了適應(yīng)該環(huán)境，必需對(duì)自身特性和適應(yīng)機(jī)能進(jìn)行修飾和改造，使其組織機(jī)能和群落結(jié)構(gòu)具有一定的特異性。

中國南方林地許多分布在對(duì)酸敏感的紅壤地區(qū)[6]。外源氮的添加對(duì)林地土壤質(zhì)量影響關(guān)系到林業(yè)可持續(xù)發(fā)展，已引起廣泛關(guān)注。樟樹Cinnamomum camphora是我國南方地區(qū)重要的材用及造林經(jīng)濟(jì)樹種。為此，文章采用BIOLOG 技術(shù)，利用AN、FF、GEN和YT 4種微孔板分別對(duì)外源氮添加不同水平下樟樹人工林紅壤微生物代謝功能多樣性進(jìn)行研究，以期為深入研究外源氮輸入對(duì)土壤微生物群落代謝功能的影響，以及為我國林業(yè)的可持續(xù)發(fā)展及環(huán)境保護(hù)提供參考。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗(yàn)地位于湖南省森林植物園（113°02′E，28°06′N）。該地氣候?qū)儆诘湫偷膩啛釒駶櫦撅L(fēng)氣候，年均氣溫約為17.2℃，年均降水量約為1 422 mm，全年無霜期為270～310 d。試驗(yàn)地海拔50～100 m，坡度12°～21°；地層主要是第四紀(jì)更新世的殘積性網(wǎng)紋紅土和砂礫，屬典型紅壤丘陵區(qū)。樟樹林是亞熱帶常見的人工林，在中性以至強(qiáng)酸性紅壤丘陵地是很好的經(jīng)濟(jì)林樹種，大約種植于1982年，其基本特征見表1。

表1 供試土壤的理化特性Table 1 Physicochemical properties of experimental soils in C. camphora forest (n = 3)

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

植物園模擬氮沉降處理樣地建于2010年5月，在樟樹林設(shè)置了面積25 m×25 m樣方9個(gè)。分別設(shè)置3個(gè)處理組，即對(duì)照處理N0、低氮處理N1和高氮處理N2，分別按： 0、5、15 g·m-2y-1進(jìn)行外加氮處理，每個(gè)處理組3個(gè)重復(fù)。根據(jù)樣地坡度，將高氮處理樣地設(shè)置于坡度較低處，防止因施氮后短期內(nèi)雨水沖刷將未溶解于土壤表層和灌木表層的氮沖刷。2010年6月，對(duì)樣地進(jìn)行氮處理。方法是根據(jù)氮處理水平，將每個(gè)樣方所施的NH4NO3(固體分析純)溶解在20 L自來水中后，以背式噴霧器人工來回均勻噴灑，噴灑高度 1.5 m左右。對(duì)照樣方N0則噴灑等量清水，以盡量減少不同處理間的差異。

1.3 土壤樣品采集

于噴施氮1個(gè)月(2010年7月)對(duì)各樣方進(jìn)行取樣，依照均勻并隨機(jī)的原則，去除凋落物層, 使用直徑5 cm“洛陽鏟”采0～10 cm的土層，按照“品”字形三點(diǎn)取樣，將每個(gè)樣方的土樣充分混合后，手撿粗根、石塊和其它雜物后，迅速裝入塑料袋并置于冰塊上，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室，4℃冰箱保存。

1.4 測定方法

試驗(yàn)使用的 BIOLOG AN、FF、GenIII和YT 4種測試板各有 96個(gè)孔，除對(duì)照組孔（第一個(gè)孔）僅有水和指示劑以外，其余孔均含有不同碳源和四唑鹽指示劑。微生物在利用單一碳源的代謝過程發(fā)生氧化還原反應(yīng)，產(chǎn)生電子轉(zhuǎn)移，從而使四唑鹽指示劑變成紫色，通過測定各板孔的吸光值及其變化來反映微生物的代謝能力的多樣性[7]。

BIOLOG GenIII板適用于測定革蘭氏好氧細(xì)菌，BIOLOG FF板適用于測定絲狀真菌，BIOLOG YT板適用于測定酵母菌，BIOLOG AN板適用于測定厭氧細(xì)菌。

具體實(shí)驗(yàn)步驟是，實(shí)驗(yàn)前應(yīng)先將待測土壤從冰箱內(nèi)提前4小時(shí)拿出，放置于室溫下恢復(fù)土壤微生物的活性。稱取10 g土樣倒入裝有90 mL滅菌生理鹽水的三角瓶中，200 r/min振蕩30 min，使土壤中微生物均勻分散，制成10-2稀釋度的土壤稀釋液。然后按10倍稀釋法進(jìn)行稀釋，取10-3倍數(shù)的上清菌液用8道移液排槍接入BIOLOG 4種微平板(150 μL/孔)。放入28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行讀數(shù)，連續(xù)10 d。

土壤微生物多樣性指數(shù)計(jì)算方法[8-9]如下：

BIOLOG 微平板反應(yīng)一般采用每孔顏色平均變化率(AWCD)來描述。

計(jì)算公式為：

式中：C 為每個(gè)有培養(yǎng)基孔的光密度值，R 為對(duì)照孔( A1) 的光密度值，n 為培養(yǎng)基碳源種類，YT板n值為 31，其余微平板(AN板、GenIII板和FF板)n值為95。

采用Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和Mclntosh指數(shù)來反映細(xì)菌群落代謝功能的多樣性。Shannon指數(shù)計(jì)算公式：

式中：Pi為第i孔吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率

Simpson指數(shù)計(jì)算公式：

式中，Pi為第i孔吸光值與整個(gè)平板相對(duì)吸光值總和的比率。

Mclntosh指數(shù)計(jì)算公式：

式中：ni為第i孔的相對(duì)吸光值。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

本文用 SPSS13.0 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，Sigmaplot10.0 輔助作圖。利用 One-Way ANOVA方差分析不同氮添加處理對(duì)土壤微生物多樣性差異顯著性(P＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 BIOLOG AN平板的AWCD值的變化

平均顏色變化率( AWCD) 是土壤微生物群落碳源利用能力的重要指標(biāo)，反映了土壤微生物的代謝活性。BIOLOG AN板用來測定土壤中的厭氧菌及其活性，平板共有96個(gè)孔，除第一孔只加水與指示劑外，其他95個(gè)孔，裝有不同的碳源。由圖1可以看出，不同施氮處理下，AWCD值呈現(xiàn)先上升后趨于平緩的趨勢(shì)。在培養(yǎng)的156 h內(nèi)，3條曲線相互交叉，而在培養(yǎng)后期，曲線才明顯分離。說明不同施氮處理對(duì)樟樹土壤微生物厭氧菌代謝活性產(chǎn)生一定的影響。表現(xiàn)為：與對(duì)照相比，高濃度施氮(N2)促進(jìn)厭氧菌代謝活性，而低濃度施氮(N1)抑制其活性。其代謝活性的先后順序?yàn)椋篘2＞ N0＞ N1。

圖1 AN板平均每孔吸光度隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig. 1 Variation of AWCD values with time in BIOLOG AN plate

2.2 BIOLOG FF平板的AWCD值的變化

BIOLOG絲狀真菌鑒定微平板(FF 板)主要用于絲狀真菌及其活性的鑒定。不同施氮處理組樟樹人工林利用平板95種不同碳源的AWCD值如圖2所示。在終止培養(yǎng)的240 h內(nèi)，BIOLOG FF平板均形成較為明顯的S型曲線。即經(jīng)過48 h短暫的調(diào)整期后迅速增長直至生長停滯期。整體上來看，對(duì)照組N0的AWCD值增加速率顯著高于其余施氮組，代謝活性的先后順序?yàn)?，N0＞N2＞N1。表明對(duì)照組的土壤微生物絲狀真菌的代謝活性較強(qiáng)。而經(jīng)不同濃度施氮處理后，樟樹土壤微生物生理活性降低，代謝減慢。

圖 2 FF板平均每孔吸光度隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig. 2 Variation of AWCD values with time in BIOLOG FF plate

2.3 BIOLOG GenIII平板的AWCD值的變化

BIOLOG GenIII平板用來測定土壤中革蘭氏陽性好氧細(xì)菌與革蘭氏陰性好氧細(xì)菌利用單一碳源的能力。其變化速率越快，BIOLOG的代謝活性就越強(qiáng)。如圖3所示，與其他微孔板相比，BIOLOG GenIII平板中細(xì)菌啟動(dòng)速度較快，在24 h之后即進(jìn)入快速生長期直至增長達(dá)到平穩(wěn)，其中曲線N0達(dá)到平穩(wěn)期所需時(shí)間最長(192 h)?？梢钥闯霾煌┑幚硗寥牢⑸锏暮醚跫?xì)菌代謝活性AWCD值均高于對(duì)照組，且施氮濃度越高代謝活性越強(qiáng)，到培養(yǎng)后期，差異更加明顯。由此進(jìn)一步說明，不同施氮處理對(duì)樟樹土壤樣品中好氧菌均起到不同程度的促進(jìn)作用。

2.4 BIOLOG YT平板的AWCD值的變化

BIOLOG YT平板是用來測定土壤中酵母菌活性。不同施氮處理土壤微生物酵母菌代謝活性產(chǎn)生一定的影響。由圖4可以看出，同BIOLOG FF平板曲線變化相似，經(jīng)過48 h調(diào)整期立即進(jìn)入增長期，且增長速率較快，直至156 h?？傮w來看，在樟樹林土壤樣品培養(yǎng)的240 h內(nèi)，對(duì)照樣地土壤微生物酵母菌利用不同碳源的AWCD變化值最高，到培養(yǎng)結(jié)束時(shí)達(dá)最高值，與對(duì)照樣地相比，不同施氮處理土壤微生物酵母菌活性均降低，大小順序依次為：N0＞N2＞N1，說明不同施氮處理抑制土壤微生物酵母菌的活性。

圖 3 樟樹GenIII板平均每孔吸光度隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig. 3 Variation of AWCD values with time in BIOLOG GenIII plate

圖4 樟樹YT板平均每孔吸光度隨時(shí)間的變化規(guī)律Fig. 4 Variation of AWCD values with time in BIOLOG YT plate

2.5 樟樹林土壤微生物群落碳代謝功能多樣性的變化

為了對(duì)土壤微生物代謝功能多樣性進(jìn)一步分析，本文分別計(jì)算了不同施氮處理水平，樟樹林土壤微生物Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)和McIntosh指數(shù)，它們分別從不同側(cè)面反映土壤微生物群落的豐富度、群落內(nèi)常見物種的優(yōu)勢(shì)度和微生物物種的均勻度。表2列出了在培養(yǎng)156 h的吸光值計(jì)算結(jié)果。不同研究人員所采用的時(shí)間和方法并不統(tǒng)一，如侯曉杰等利用48 h的值[10]，羅希茜等采用72 h[11]，鄭華等則采用當(dāng)AWCD值接近0.6時(shí)來確定時(shí)間的方法[12]。在本研究中，土壤微生物經(jīng)過延滯期適應(yīng)BIOLOG測試板提供的環(huán)境，然后對(duì)數(shù)生長至156 h之后生長減緩進(jìn)入穩(wěn)定期。

表2 不同氮處理樟樹樣地土壤微生物多樣性變化(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3)Table 2 Changes of soil microbial diversity in C. camphora forest under different N treatments(means ± SE,n = 3)

多樣性指數(shù)結(jié)果表明，樟樹林樣地，不同施氮處理BIOLOG AN平板和BIOLOG GenIII 平板3個(gè)指數(shù)均顯著高于對(duì)照樣地，表明一定的施氮促進(jìn)土壤微生物細(xì)菌代謝功能多樣性；BIOLOG FF平板顯示，不同施氮水平3個(gè)指數(shù)中除Shannon指數(shù)較施氮組高外，其他指數(shù)均不同程度的低于對(duì)照樣地，其中高氮處理樣地N2達(dá)到顯著水平，說明外源氮輸入抑制土壤微生物絲狀真菌代謝功能多樣性；相比之下BIOLOG YT平板對(duì)照樣地N0的Simpson指數(shù)高于其他施氮處理樣地，但未達(dá)到顯著水平，而Shannon指數(shù)和McIntosh指數(shù)低于施氮組。說明表征土壤微生物酵母菌代謝功能多樣性的3個(gè)指數(shù)表現(xiàn)不一致。

3 結(jié)論與討論

本研究通過BIOLOG 4 種微生物平板對(duì)樟樹人工林紅壤微生物代謝功能及其多樣性的研究表明，外源氮添加不同水平的處理對(duì)土壤微生物群落代謝功能有不同程度的影響。具體表現(xiàn)為，氮添加對(duì)土壤微生物細(xì)菌的代謝功能具有促進(jìn)作用，而抑制土壤微生物真菌和酵母菌的活性。大量研究表明施氮可以通過改變土壤養(yǎng)分的有效性以及調(diào)節(jié)土壤養(yǎng)分的儲(chǔ)存和轉(zhuǎn)化，改變土壤肥力，從而刺激土壤微生物的生長[13-14]，但長期施氮會(huì)對(duì)土壤微生物活性起到抑制作用[15]。這與王曙光[16]等中國科學(xué)院禹城實(shí)驗(yàn)站研究結(jié)果不一致，可能與施肥量、各地水熱條件、土壤類型及理化性質(zhì)等的不同而有關(guān)，原因有待進(jìn)一步的研究。土壤微生物群落功能的多樣性與土壤類型及土壤肥力密切相關(guān)[17-19]。不同的施氮處理對(duì)土壤微生物產(chǎn)生不同的影響。施氮可能通過使土壤中的碳，氮以及土壤pH值發(fā)生變化影響土壤微生物的代謝功能，從而進(jìn)一步使微生物利用碳源的能力以及群落功能多樣性發(fā)生變化。

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Effects of nitrogen addition on metabolic function of microbial community in red soil of Cinnamomum camphora forest

YU Pei-yi1,2, ZHU Fan1,2, WANG Zhi-yong1,2, YAN Wen-de1,2, SU Shao-feng1,2, LI Tian-ping1,2
(1.School of Life Science and Technology, Central-South University of Forestry & Technology, Changsha 410004, Hunan, China;2. National Engineering Lab. For Applied Technology of Forestry & Ecology in South China, Changsha 410004, Hunan, China)

In order to study the effects of nitrogen addition on soil microbial metabolic characteristics，the metabolic activity and the diversity of soil microbial community were determined by four kinds of plates(BIOLOG AN, FF, GenIII and YT plates)with different nitrogen treatments on Cinnamomum camphora forest in Hunan Botanical Garden. The results show that (1) a high concentration of nitrogen promoted metabolic function of soil microbial anaerobic bacteria, and low nitrogen concentration inhibited its activity; (2) For the soil microbial gram aerobic bacteria，the metabolic function were enhanced signif i cantly under different nitrogen additions; (3) In addition, the metabolic activity of soil microbial fungi and yeast were avoided by different nitrogen additions. The research results of soil microbial diversity were similar to the trend of soil microbial metabolic activity.

nitrogen addition；BIOLOG；microbial community; metabolic function; diversity

S792.23

A

1673-923X(2013)03-0070-05

2012-10-16

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國家科技計(jì)劃課題(2011BAD38B0204)；國家林業(yè)局推廣項(xiàng)目(2012-64)；湖南省自然基金項(xiàng)目(10JJ3003)；湖南省林業(yè)廳項(xiàng)目；湖南省普通高校青年骨干教師培養(yǎng)對(duì)象

郁培義（1984-），男，山西太原人，碩士研究生，主要從事城市生態(tài)學(xué)研究工作

朱 凡（1973-），女，湖南武漢人，副教授，博士，主要從事森林生態(tài)方面的研究；E-mail：forestranger33@hotmail.com

[本文編校：吳 毅]