固體發(fā)酵體系中白腐菌Echinodontium spp.的產(chǎn)酶特性研究

黃慧艷，劉 波 ，余洪波，張曉昱

（1. 華中科技大學 a.武昌分校；b.生命科學與技術(shù)學院，湖北武漢 430064；2.武漢市糧油食品中心檢驗站，湖北 武漢 430021）

固體發(fā)酵體系中白腐菌Echinodontium spp.的產(chǎn)酶特性研究

黃慧艷1a，劉 波2，余洪波1b，張曉昱1b

（1. 華中科技大學 a.武昌分校；b.生命科學與技術(shù)學院，湖北武漢 430064；2.武漢市糧油食品中心檢驗站，湖北 武漢 430021）

研究了固體發(fā)酵體系中選擇性降解白腐菌株Echinodontium spp.在杉木(裸子植物)、毛竹(單子葉植物)和垂柳(雙子葉植物)木質(zhì)纖維素基質(zhì)上木質(zhì)素降解酶系、纖維素降解酶系的產(chǎn)生特性。結(jié)果表明：基質(zhì)種類對白腐菌的纖維素酶產(chǎn)生特性沒有較大影響；而木質(zhì)素降解酶均呈現(xiàn)出培養(yǎng)前期高于后期的現(xiàn)象，且不同基質(zhì)中酶活力水平差異明顯，杉木基質(zhì)上的酶活力水平明顯低于毛竹和垂柳基質(zhì)中的狀況。木質(zhì)素降解酶系的活力水平與木質(zhì)素降解速率的變化趨勢一致，但纖維素酶系的活力水平和纖維素降解速率之間并未呈現(xiàn)必然關(guān)聯(lián)。木質(zhì)素酶系對底物基質(zhì)的有效降解，可能有利于纖維素酶在木質(zhì)纖維素復合物體系中的滲透，從而增效纖維素的酶解。

白腐菌；木質(zhì)素降解酶系；纖維素降解酶系；固體發(fā)酵

白腐菌可以分泌一系列木質(zhì)纖維素降解酶系，是自然界中植物殘體的主要降解者之一[1]。至今，纖維素內(nèi)/外切酶、漆酶、錳過氧化物酶等白腐菌降解酶系已獲得充分研究[2-6]，但大多數(shù)降解酶系相關(guān)研究均在液體培養(yǎng)條件下進行[7]，由于自然環(huán)境中白腐菌降解木質(zhì)纖維素基質(zhì)是一個固態(tài)發(fā)酵過程，故液體深層培養(yǎng)條件下降解酶系的產(chǎn)生特性難以表征白腐菌在自然狀態(tài)下的降解特性[8]。

例如，木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)在液體發(fā)酵體系中被明確是木質(zhì)素的主要降解酶之一，然而至今仍難以證實其在天然狀態(tài)木質(zhì)纖維素基質(zhì)上的表達，其在木質(zhì)纖維素降解中的作用特性也不清楚。另一方面，白腐菌固體培養(yǎng)體系中的降解酶產(chǎn)生模式不僅與菌株相關(guān)，且與木質(zhì)纖維素基質(zhì)的特異性也有著很大關(guān)聯(lián)，如靈芝菌種于楊木基質(zhì)上培養(yǎng)可合成錳過氧化物酶而于杉木基質(zhì)中培養(yǎng)則不合成。所以，研究固體培養(yǎng)條件下白腐菌降解酶系的產(chǎn)生特性很有必要。

研究了選擇性降解木質(zhì)素的白腐菌株Echinodontium spp.在毛竹(單子葉植物)、垂柳（雙子葉植物）和杉木(裸子植物)木質(zhì)纖維素基質(zhì)降解過程中合成的木質(zhì)素酶系、纖維素酶系，初步探討了不同基質(zhì)上降解酶系的產(chǎn)生特性與白腐菌降解性能之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 菌 株

白腐菌株Echinodontium spp.。

1.2 藥品及儀器

(1)主要藥品

下列藥品購自Sigma公司(分析純)：ABTS[2,2’-連氮-二-(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)]、CMCNa、微晶纖維素。

下列藥品均為常規(guī)國產(chǎn)(分析純)：Tween80、DNS試劑、丙二酸鈉、丙二酸、醋酸鈉、醋酸、葡萄糖。

(2)主要設備與儀器

可見/紫外分光光度計：尤尼柯(上海)有限公司，UNICO-UV-2000。

其他微生物培養(yǎng)、生物化學分析測試的常規(guī)設備與儀器。

1.3 菌種培養(yǎng)和基質(zhì)降解

種子培養(yǎng)基：85%（m/V）玉米秸稈粉、2%（m/V）蔗糖、10%(m/V)麩皮粉、3%(m/V)棉籽殼、300%(V/V)蒸餾水?；靹?，分裝至90 mm平板中，每個平板分裝4 g，121 ℃滅菌20 min。接種白腐菌株Echinodontium spp.，于25 ℃條件下培養(yǎng)約10 d。

分別將已烘干的毛竹、垂柳和杉木莖稈木粉5.0 g放于125 mL三角瓶中，各加入蒸餾水10、12.5和15 mL，于121 ℃下滅菌20 min。每瓶接入直徑為1 cm的Echinodontium spp.種子菌塊2塊，塑料膜封口且當菌絲長滿三角瓶后將其倒置，以防止水分流失。未接種菌塊的三角瓶作為空白。三角瓶置于25 ℃條件培養(yǎng)，分別于不同的培養(yǎng)時間 10、20、30、40、50、60、90、120 d時取樣，小心剝?nèi)ツ举|(zhì)纖維素基質(zhì)表面的接種塊，備測定用。

1.4 酶液提取與測定

(1)酶液提取

在設定的培養(yǎng)時間點取樣，向每個三角瓶內(nèi)加入含0.01% Tween80的0.05 mol醋酸緩沖液(pH5.0)45 mL，將培養(yǎng)物攪散后置搖床上150 r/min持續(xù)振蕩6 h，過濾得濾液備測木質(zhì)素降解酶、纖維素降解酶的活力。

(2)纖維素降解酶活力測定

利用濾紙酶活表征總纖維素酶的活力，并分別測定了纖維素降解酶系的二個主要組分：纖維素內(nèi)切酶(Endoglucanase，EG)、纖維素外切酶(Cellobiohydrolase，CBH)的活力。

總纖維素酶測定(濾紙酶活FPU法)[9]：底物為1 cm×3 cm的濾紙條，將其以電子天平稱重使質(zhì)量保證為(25±1) mg，放入試管中。酶液用0.05 mol醋酸緩沖液(pH5.0)稀釋至一定濃度，取0.5 mL稀釋酶液加入1.0 mL醋酸緩沖液(pH4.8)，置50 ℃水浴1 h，然后迅速冷卻并加入2.0 mL DNS試劑終止反應，試管以塑料紙封口后再置沸水浴內(nèi)10 min，迅速冷卻并于540 nm測定吸光值。酶活力以反應進行1 h內(nèi)的還原糖變化量表示。1個酶活單位定義為每分鐘使葡萄糖轉(zhuǎn)化的微摩爾數(shù)。

纖維素內(nèi)切酶、纖維素外切酶的測定分別采用CMCNa法[10]、微晶纖維素法[10]。酶液用0.05 mol醋酸緩沖液(pH5.0)稀釋至一定濃度，取0.5 mL稀釋酶液迅速加入1.0 mL 0.5%底物(CMCNa、微晶纖維素)溶液，置50 ℃水浴0.5 h后，迅速加入2.0 mL DNS試劑終止反應，試管以塑料紙封口后再置沸水浴內(nèi)10 min，迅速冷卻并于540 nm測定吸光值。1個酶活單位定義為每分鐘使底物轉(zhuǎn)化的微摩爾數(shù)。

(3)木質(zhì)素降解酶活力測定

兩種主要的木質(zhì)素降解酶：漆酶(Lac)、錳過氧化物酶(MnP)被測定。

漆酶測定(ABTS法)：酶液用0.05 mol醋酸緩沖液(pH5.0)稀釋至一定濃度，取1.0 mL稀釋酶液加入1.5 mL 1 mmol的ABTS底物液，于420 nm測定吸光值，每15 s鐘記錄一次數(shù)據(jù)。1個酶活單位定義為每分鐘使底物轉(zhuǎn)化的微摩爾數(shù)[11]。

錳過氧化物酶測定(丙二酸法)：酶液用0.05 mol醋酸緩沖液(pH5.0)稀釋至一定濃度，取1.5 mL稀釋酶液加入1.0 mL 4 mmol的MnSO4溶液、1.0 mL 0.2 mol丙二酸緩沖液(pH4.0)，隨后加入1.0 mL 0.4 mmol的H2O2溶液，并立即于270 nm測定吸光值，每15 s記錄一次數(shù)據(jù)。1個酶活單位定義為每分鐘使底物轉(zhuǎn)化的微摩爾數(shù)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 基質(zhì)種類對Echinodontium spp.產(chǎn)木質(zhì)素降解酶的影響

前期研究確認，在Echinodontium spp.的固體培養(yǎng)體系中也無法檢測到木質(zhì)素過氧化物酶活性，因此僅測定了漆酶和錳過氧化物酶的活力。如圖1～2所示，從整體水平來看，均以毛竹基質(zhì)上的漆酶和錳過氧化物酶活力最高，以杉木基質(zhì)上的兩種酶活力最低，三種基質(zhì)間的酶活力水平差異明顯。漆酶活性于降解初期(前10 d)已達到最高水平，隨后下降。毛竹基質(zhì)上漆酶活力下降較緩，至降解的末期仍保持有較高酶活，杉木基質(zhì)上漆酶活力下降最快，至降解后期酶活已極低。菌株在毛竹基質(zhì)上產(chǎn)生的錳過氧化物酶活力顯著高于其在杉木和垂柳基質(zhì)上的酶活，最高達1 158 IU/g，而杉木和垂柳基質(zhì)中的錳過氧化物酶活力均低于500 IU/g。三種基質(zhì)上的錳過氧化物酶活力均在降解前期30 d內(nèi)達峰值，之后逐漸降低，于降解末期至低酶活甚至無法檢測。

圖1 Echinodontium spp.在毛竹(▲)、垂柳(■)和杉木(●)木質(zhì)纖維素機制上的Lac活力Fig.1 Lac activities of Echinodontium spp.: to P. pubescens(▲), S. babylonica (■) and C. lanceolata (●)

2.2 基質(zhì)種類對Echinodontium spp.產(chǎn)纖維素酶的影響

圖2 Echinodontium spp.在毛竹(▲)、垂柳(■)和杉木(●)木質(zhì)纖維素基質(zhì)上的MnP活力Fig.2 MnP activity of Echinodontium spp.to P. pubescens(▲), S. babylonica (■) and C. lanceolata (●)

圖3 Echinodontium spp.在毛竹(▲)、垂柳(■)和杉木(●)木質(zhì)纖維素基質(zhì)上的總纖維素酶活Fig.3 Total cellulase activities of Echinodontium spp. to P. pubescens (▲), S. babylonica (■) and C. lanceolata (●)

圖4 Echinodontium spp.在毛竹(▲)、垂柳(■)和杉木(●)木質(zhì)纖維素基質(zhì)上的EG活力Fig.4 EG activity of Echinodontium spp. to P. pubescens(▲), S. babylonica (■) and C. lanceolata (●)

圖3～5顯示了Echinodontium spp.在三類不同的木質(zhì)纖維素基質(zhì)上培養(yǎng)，其降解過程中產(chǎn)生的纖維素酶活力。結(jié)果表明：三種基質(zhì)上纖維素酶的活力水平均呈現(xiàn)前高后低的趨勢。Echinodontium spp.在三類基質(zhì)上表現(xiàn)的總纖維素酶活力無顯著差異(P＜0.01)，因此基質(zhì)種類對菌株總纖維素酶的產(chǎn)生并沒有很大影響；Echinodontium spp.在毛竹基質(zhì)中較早獲得較高的纖維素內(nèi)切酶活力(于培養(yǎng)第20 d時達峰值)，隨后垂柳與杉木基質(zhì)上也產(chǎn)生較高的纖維素內(nèi)切酶活力(均于培養(yǎng)第30 d獲得峰值)，三種基質(zhì)上的纖維素內(nèi)切酶活力水平變化規(guī)律與總纖維素酶的活力變化相似；而三種基質(zhì)上產(chǎn)生的纖維素外切酶活力在整個降解過程中均呈很低水平，尤其在降解后期基本無活性表現(xiàn)。

圖5 Echinodontium spp.在毛竹(▲)、垂柳(■)和杉木(●)木質(zhì)纖維素基質(zhì)上的CBH活力Fig.5 CBH activity of Echinodontium spp. to P. pubescens(▲), S. babylonica (■) and C. lanceolata (●)

2.3 酶活產(chǎn)生與木質(zhì)纖維素降解之間的關(guān)系

固體培養(yǎng)體系中Echinodontium spp.表現(xiàn)了很高的錳過氧化物酶與漆酶活力水平，且在降解中期之前高于降解中期之后，至降解后期時各酶活均已很低甚至未能檢測，這與前期工作中發(fā)現(xiàn)的三種基質(zhì)中木質(zhì)素降解速率“前期快、后期緩”的變化規(guī)律相一致。此外，Echinodontium spp.在杉木基質(zhì)上的兩種木質(zhì)素降解酶活力均低于垂柳與毛竹基質(zhì)上的酶活水平，白腐菌株對杉木基質(zhì)中木質(zhì)素的降解率總體上也低于其他兩類基質(zhì)(另文發(fā)表)，這也顯示了木質(zhì)素降解酶系和木質(zhì)素降解率之間的相關(guān)性。另一方面，木質(zhì)素的化學組成與結(jié)構(gòu)對其降解酶系作用的抗性影響也不可忽視，研究表明：裸子植物(如杉木)木質(zhì)素含量幾乎為被子植物(如垂柳和毛竹)的兩倍且G單體的含量較高，因此比被子植物的木質(zhì)素更不易被降解[13-14]。

先期工作中已發(fā)現(xiàn)(另文發(fā)表)，以菌株Echinodontium spp.處理三種木質(zhì)纖維素基質(zhì)，毛竹和垂柳基質(zhì)上至培養(yǎng)中期后纖維素的降解將由低速轉(zhuǎn)變?yōu)楦咚伲寄净|(zhì)上纖維素一直呈低速降解狀態(tài)。上文數(shù)據(jù)顯示：菌株在三種木質(zhì)纖維素基質(zhì)上產(chǎn)生的纖維素酶系活力并無顯著差異，且表現(xiàn)為降解早期高于降解晚期。這說明白腐菌株在降解不同類型木質(zhì)纖維素的過程中，其纖維素酶系的活性水平和基質(zhì)中纖維素的降解速率之間并未呈現(xiàn)必然關(guān)聯(lián)。

由于物質(zhì)的酶促降解涉及酶與底物兩項因素，因此底物的特性差異即可能是造成纖維素降解速率改變的原因所在。已知，做為木質(zhì)纖維素復合物組分之一的纖維素，其降解過程并非是孤立的[15-17]。在酶促反應過程中，其他組分的存在狀態(tài)將影響纖維素的降解，天然木質(zhì)纖維素基質(zhì)通常比純的纖維素(例如濾紙、棉花等)更難于降解也正是因此。另外，雖然不同來源纖維素的組成與結(jié)構(gòu)并沒有太大差異，但木質(zhì)素與半纖維素組分的化學組成與結(jié)構(gòu)卻往往存在顯著區(qū)別，所以不同木質(zhì)纖維素基質(zhì)的降解過程也是有差異的。研究即證實，裸子植物(如杉木)木質(zhì)纖維素基質(zhì)中的纖維素組分更難于受纖維素酶降解[15,18-20]。從這一角度考慮，毛竹和垂柳基質(zhì)上木質(zhì)素酶活水平高，早中期木質(zhì)素降解能力較強，因而可能有利于纖維素酶于培養(yǎng)中后期時在木質(zhì)纖維素基質(zhì)中的滲透，從而在中后期纖維素酶活力水平下降時仍增強了纖維素的降解；杉木基質(zhì)上木質(zhì)素酶活水平低，同時受到木質(zhì)素化學組成與結(jié)構(gòu)對其降解的抗性影響，故木質(zhì)素降解能力弱，因而可能阻礙了纖維素酶于培養(yǎng)中后期在木質(zhì)纖維素基質(zhì)中的滲透，所以在整個培養(yǎng)過程中纖維素始終處于低速降解狀態(tài)。

3 結(jié) 論

在固體發(fā)酵過程中，木質(zhì)纖維素基質(zhì)種類對白腐菌的纖維素酶產(chǎn)生特性沒有較大影響，纖維素酶系活力水平均呈現(xiàn)降解前期高于降解后期的規(guī)律；而不同基質(zhì)上木質(zhì)素降解酶的產(chǎn)生則差異明顯，酶活力水平由高到低可概括為：毛竹＞垂柳＞杉木。木質(zhì)素降解酶系的活力水平與木質(zhì)素降解“前高后低”的趨勢相一致，但纖維素酶系的活力水平和纖維素降解速率之間并未呈現(xiàn)必然關(guān)聯(lián)，其原因可能在于木質(zhì)素酶系對底物基質(zhì)的有效降解，有利于纖維素酶在木質(zhì)纖維素復合物體系中的滲透，從而增效纖維素的酶解。

[1] Ferraz A. Biodegradation of Pinus radiata softwood by white-and brown-rot fungi[J]. World Journal of Microbiology and biotechnology, 2001,17： 31-34.

[2] Arai Y. The stimulation of extracellular carbohydrases of edible mushrooms by the hot water-soluble fraction from corn fi ber[J].Mycoscience, 2005,46(4)：235-240.

[3] Asiegbu F O, Paterson A, Smith J E. Inhibition of cellulose saccharification and glycolignin-attacking enzymes of five lignocellulose-degrading fungi by ferulic acid[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 1996,12(1)：16-21.

[4] Barrasa J M. Electron and Fluorescence Microscopy of Extracellular Glucan and Aryl-Alcohol Oxidase during Wheat-Straw Degradation by Pleurotus eryngii[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1998, 64(1)：325-332.

[5] Reddy C A. An overview of the recent advances on the physiology and molecular biology of lignin peroxidases of Phanerochaete chrysosporium[J]. Journal of Biotechnology,1993, 30(1)： 91-107.

[6] Khalil A I. Production and characterization of cellulolytic and xylanolytic enzymes from the ligninolytic white-rot fungus Phanerochaete chrysosporium grown on sugarcane bagasse[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2002,18(8)：753-759.

[7] Masaphy S, Levanon D.The effect of lignocellulose on lignocellulolytic activity of Pleurotus pulmonarius in submerged culture[J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 1992,36(6)： 828-832.

[8] Hatakka A. Biodegradation of lignin, in Lignin, Humic Substances and Coal, M. Hofrichter and A. Steinbüchel,Editors[J]. WILEY-VCH： Helsinki,2001：129-167.

[9] Cai Y J. Production and distribution of endoglucanase,cellobiohydrolase, and beta-glucosidase components of the cellulolytic system of Volvariella volvacea, the edible straw mushroom[J]. Applied and Environmental Microbiology, 1999,65(2)：553-9.

[10] Mata G, Hernndez D M M, Andreu L G I. Changes in lignocellulolytic enzyme activites in six Pleurotus spp. strains cultivated on coffee pulp in confrontation with Trichoderma spp.[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology, 2005, 21(2)：143-150.

[11] Hakalaa T K. Manganese peroxidases, laccases and oxalic acid from the selective white-rot fungus Physisporinus rivulosus grown on spruce wood chips[J].Enzyme and Microbial Technology, 2005,36(4)：461-468

[12] Steffen K T, Hofrichter M, Hatakka A. Mineralisation of 14C-labelled synthetic lignin and ligninolytic enzyme activities of litter-decomposing basidiomycetous fungi[J]. Appl Microbiol Biotechnol, 2000,54(6)：819-25.

[13] Vanea C H, Drageb T C, Snapeb C E. Bark decay by the white-rot fungus Lentinula edodes： Polysaccharide loss, lignin resistance and the unmasking of suberin[J]. International Biodeterioration and Biodegradation, 2006,57(14-23).

[14] Martinez A T. Studies on wheat lignin degradation by Pleurotus species using analytical pyrolysis. Journal of Analytical and Applied Pyrolysis, 2001,58-59：401-411.

[15] Ramos L P.The effect of Trichoderma cellulases on the fine structure of a bleached softwood kraft pulp[J].Enzyme and Microbial Technology, 1999,24(7)：371-380.

[16] Yoshimoto M. Effects of ultrasonic intensity and reactor scale on kinetics of enzymatic saccharification of various waste papers in continuously irradiated stirred tanks[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2005,12 (5)：373-384.

[17] Wyman C. Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass[J]. Bioresource Technology,2005,96(6)：673-686.

[18] Gregg D J, Saddler J N. Factors affecting cellulose hydrolysis and the potential of enzyme recycle to enhance the efficiency of an integrated wood to ethanol process[J]. Biotechnology and Bioengineering, 1996,51(4)：375-383.

[19] Ziemer C, Ragauskas A J. CP/MAS 13C NMR analysis of cellulase treated bleached softwood kraft pulp[J]. Carbohydrate Research, 2006, 341(5)：591-597.

[20] 劉 波,黃慧艷,余洪波,等.木質(zhì)纖維素各類對白腐菌降解選擇性的影響[J].中南林業(yè)科技大學學報,2012,32(8)：108-111.

Study on enzyme-producing properties of white rot fungus(Echinodontium spp.) on solid lignocellulose-degradation

HUANG Hui-yan1a, LIU Bo2, YU Hong-bo1b, ZHANG Xiao-yu1b
(1a. Wuchang Branch Campus; 1b. School of Life Science and Technology, Huazhong University of Science and Technology,Wuhan 430064, Hubei, China; 2. Wuhan Central Inspection of Grain and Food, Wuhan 430021, Hubei, China)

The characteristics of lignolytic and cellulolytic enzymes production by white rot fungi Echinodontium spp. based on lignocellulose such as Chinese fir, bamboo and Chinese willow were studied. The results show that the cellulytic enzymes did not affect obviously by the type of substrates while the lignolytic enzymes based on different materials had remarkably differences, all the lignolytic activities were higher at early stage of culture than later, the enzymatic activities based on Chinese fi r were much lower than those based on bamboo and Chinese willow; the changeing trend of lignin degradation rate coincided with the variation of lignolytic activities, but there was no necessarily relationship between the cellulose degradation rate and the cellulytic activities; the effective degradation of substrates by lignolytic enzymies may promote the penetration of cellulases into lignocellulose which may contribute to the improvement of cellulose degradation.

Echinodontium spp.; lignolytic enzyme; cellulolytic enzyme; solid degradation

S789.8

A

1673-923X(2013)03-0025-05

2012-07-06

國家自然科學基金青年項目（30901137）

黃慧艷（1977-），女，湖南溆浦人，講師，博士，主要從事木質(zhì)纖維素生物降解研究；E-mail： hyhuang@mail.hust.edu.cn

劉 波（1979-），男，湖北黃石人，工程師，碩士，主要從事生化分析工作與研究；E-mail：huanyueyuji@sina.com

[本文編校：吳 毅]