RKIP基因表達上調對宮頸癌細胞生物學行為影響

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(青島大學醫(yī)學院,山東 青島 266003 1 附屬醫(yī)院婦科； 2 病原生物學教研室)

宮頸癌是女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，近年來發(fā)病呈上升趨勢，且病人逐漸年輕化。轉移是影響宮頸癌預后的重要因素。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是一種高度保守、廣泛表達的小分子胞漿蛋白，是磷脂酰乙醇胺結合蛋白(PEBP)家族成員，在細胞的多種信號轉導通路中起重要的調節(jié)作用。近年來的研究結果顯示，RKIP具有抑制腫瘤細胞轉移的作用，RKIP在腫瘤治療中的作用已成為腫瘤細胞生物學領域中的一個新的研究熱點。已有研究結果顯示，RKIP是一種新的前列腺癌轉移抑制基因，RKIP在宮頸癌細胞及其轉移的淋巴結組織中表達減弱或丟失[1-5]。因此推測RKIP基因可能在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展和轉移中發(fā)揮重要作用。本研究采用脂質體轉染法，將含有正義(ss)RKIP cDNA 的真核表達載體導入宮頸癌Caski細胞，建立RKIP表達上調的穩(wěn)定轉染細胞系，觀察RKIP基因對宮頸癌細胞體外增殖、錨定非依賴性生長和侵襲等生物學行為的影響，為深入探討RKIP基因在宮頸癌發(fā)生、發(fā)展、轉移和預后中的作用及其機制奠定基礎。 現(xiàn)將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人宮頸癌細胞Caski細胞系，本實驗室保存。細胞用含體積分數(shù)0.10胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2細胞培養(yǎng)箱內培養(yǎng)。真核表達載體pcDNA3.1(+)和含有ssRKIP cDNA 的質粒，由美國密歇根大學EVEN T KELLER 教授惠贈。DMEM培養(yǎng)基，購自Thermo scientific 公司；無內毒素FBS，購自杭州天杭生物科技公司；Matrigel基質膠，購自美國BD公司；牛血清清蛋白(BSA)，購自美國Sigma公司；Lipofectamine 2000 轉染試劑，購自美國Invitrogen公司；G418，購自Amresco公司；羊抗人RKIP，購自美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標記兔抗羊二抗，購自北京博奧森公司。

1.2 實驗方法

1.2.1RKIP基因轉染及陽性細胞的篩選 轉染前1 d，將人宮頸癌Caski細胞以每孔3×105個接種于6孔培養(yǎng)板， 24 h后達到90%細胞融合，按照Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書步驟將pcDNA3.1(+)和 pcDNA3.1(+)-ssRKIP質粒分別轉染到Caski細胞中。轉染48 h后，細胞按照1∶4傳代，用含500 mg/L G418的DMEM培養(yǎng)基進行篩選,每3 d換液1次。2～3周后挑取G418抗性克隆，200 mg/L G418維持濃度擴大培養(yǎng)，建立穩(wěn)定轉染細胞系。

1.2.2Westren-blot法檢測轉染前后細胞RKIP蛋白的表達 收集生長狀態(tài)良好的穩(wěn)定轉染細胞及未轉染細胞，加入細胞裂解液，冰上裂解30 min后，以12 000 r/min離心15 min，小心吸取上清即為細胞總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測定其蛋白濃度。取30 μg細胞總蛋白用120 g/L的丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離，蛋白電轉移至PVDF膜上，50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。然后用封閉液稀釋的一抗室溫孵育2 h(羊抗人RKIP抗體1∶25 000稀釋，鼠抗人內參抗體1∶5 000稀釋)；TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；封閉液稀釋的二抗室溫孵育1 h(辣根過氧化物酶標記的兔抗羊或抗鼠抗體1∶1 000稀釋)；用TBST緩沖液洗膜3次，每次10 min；ECL試劑發(fā)光、顯影和定影。實驗重復3次。結果應用Quantity One軟件進行灰度值分析，以β-actin為內參照，以細胞轉染前后RKIP蛋白與β-actin蛋白灰度值的比值作為RKIP蛋白的相對表達含量。

1.2.3MTT檢測細胞增殖 取生長狀態(tài)良好的pcDNA3.1(+)轉染細胞、ssRKIP細胞、未轉染的Caski細胞，以2.5×106/L的密度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔200 μL，每組設5個復孔，于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后，每孔加入20 μL MTT(5 g/L)后繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸凈培養(yǎng)液后每孔加入100 μL DMSO溶液，輕微震蕩5 min待溶液完全溶解后，用酶標儀測定波長570 nm處的吸光度值(A值)。實驗重復3次，計算出各時間點的平均值，繪制生長曲線,分析其增殖能力。

1.2.4雙層軟瓊脂集落形成實驗 將12 g/L瓊脂與含體積分數(shù)0.10 FBS的DMEM培養(yǎng)基等體積混合，立即加入6孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，待瓊脂凝固后備用；將6 g/L瓊脂與含有密度2×107/L細胞及含體積分數(shù)0.20 FBS的DMEM培養(yǎng)基等體積混合，使細胞密度為1×107/L，分別加入到含有底層瓊脂的6孔培養(yǎng)板中，每孔1 mL，每組細胞設3個復孔，在37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內培養(yǎng)10～14 d。于倒置顯微鏡下計數(shù)細胞數(shù)大于50個的克隆，計算克隆形成的平均數(shù)。實驗重復3次。

1.2.5Transwell小室侵襲實驗 將小室置于4 ℃預冷后，濾膜底部涂以人工基底膜基質凝膠matrigel 25 μL(凝膠用無血清DMEM培養(yǎng)液稀釋為0.2 g/L),37 ℃環(huán)境下作用30 min，待matrigel膠在微孔濾膜上重組為基底膜結構，PBS沖洗。24孔板內加入含1 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液，每孔600 μL。5種細胞胰酶消化后，用含有1 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液調整細胞密度為1×109/L，小室內加入100 μL細胞懸液后浸入含有1 g/L BSA的DMEM培養(yǎng)液中，于37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內孵育8～10 h。取出小室，PBS沖洗3次，結晶紫染色，棉簽拭去膜表面上的細胞，高倍顯微鏡下觀察并計數(shù)穿過膜的細胞數(shù)。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 穩(wěn)定轉染細胞系的建立

經過3周的G418(500 mg/L)篩選，成功建立了既上調表達RKIP基因又具有G418抗性的穩(wěn)定轉染宮頸癌Caski細胞(ssRKIP細胞)，并同時獲得了空載體pcDNA3.1(+)穩(wěn)定轉染細胞(pcDNA3.1(+)細胞)。

2.2 轉染前后細胞中RKIP基因表達的比較

與未轉染細胞相比，ssRKIP細胞的RKIP蛋白表達水平上調，pcDNA3.1(+)轉染細胞RKIP蛋白的表達水平變化不大(圖1)；ssRKIP細胞RKIP蛋白的相對表達含量為2.13，空載體pcDNA3.1(+)轉染細胞為1.12,未轉染細胞為1.08。

2.3 RKIP基因轉染前后各組細胞體外增殖能力的比較

實驗48、60、72 h，空載體pcDNA3.1(+)轉染細胞的體外增殖能力與未轉染組細胞比較差異無顯著性(t=2.13～3.20，P均>0.05)；ssRKIP細胞的體外增殖能力明顯低于未轉染組，差異有顯著意義(t=6.22～7.16，P均<0.01)。見圖2。

①未轉染細胞；②pcDNA3.1(+)轉染細胞；③ssRKIP細胞。

圖2 RKIP基因轉染Caski細胞前后細胞的體外增殖能力

2.4 RKIP基因轉染前后細胞的錨定非依賴性生長能力比較

軟瓊脂集落形成實驗結果顯示，各組細胞均能在軟瓊脂中形成細胞集落。ssRKIP組細胞克隆形成數(shù)為112.78±5.60，未轉染組為151.55±6.14，pcDNA3.1(+)轉染組為159.11±3.64，ssRKIP組與未轉染組相比較，差異有顯著意義(t=8.14,P<0.01)；而未轉染組與pcDNA3.1(+)轉染組比較，差異無統(tǒng)計學意義(t=3.80，P>0.05)。

2.5 RKIP基因轉染前后細胞體外侵襲能力比較

ssRKIP組穿膜細胞數(shù)為54.33±4.12，未轉染組為80.00±3.20，pcDNA3.1(+)轉染組為76.00±2.52，ssRKIP組與pcDNA3.1(+)轉染組比較，差異有顯著性(t=9.24，P<0.01)；pcDNA3.1(+)轉染組與未轉染組比較，差異無顯著性(t=3.26，P>0.05)。

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，轉移是影響宮頸癌預后的重要因素之一。已有研究表明，Ⅰb～Ⅱa期的子宮頸癌病人若無盆腔淋巴結轉移，其5年生存率可達85%～90%；而一旦有區(qū)域淋巴結轉移，其5年生存率則降為30%～60%，即使常規(guī)病理檢查無淋巴結轉移等高危因素的病人，仍有10%出現(xiàn)復發(fā)和轉移[1-2]。轉移是一個復雜的、多步驟的癌細胞和宿主相互作用的過程。腫瘤細胞從原初病灶逃逸，進入循環(huán)系統(tǒng)，然后侵襲到一個遠離的組織位點，在該靶位點生長成為一個肉眼可見的腫瘤。明確惡性腫瘤轉移發(fā)生的關鍵機制，阻斷腫瘤的轉移是提高病人生存率、根治腫瘤的希望所在。

RKIP是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種腫瘤轉移抑制基因。FU等[3-4]研究顯示，RKIP基因在轉移的前列腺癌細胞C4-2B中的表達明顯低于非轉移性的前列腺癌細胞LNCaP，過量表達RKIP的前列腺癌細胞C4-2B的體外侵襲能力減弱，推斷RKIP是一種新的前列腺癌轉移抑制基因。隨后，這一推斷在黑色素瘤及乳癌中得到證明[8-11]。近年來有研究結果顯示，RKIP在正常宮頸組織及宮頸上皮內瘤變組織的表達無明顯差異，而在宮頸癌組織的表達低于正常宮頸組織及宮頸上皮內瘤變組織，在宮頸癌轉移淋巴結組織的陽性表達率低于宮頸癌組織,推斷RKIP基因在宮頸上皮內瘤變向宮頸癌轉變中可能起重要作用，RKIP基因可作為宮頸癌良惡性鑒別診斷的標志，可能是宮頸癌的轉移抑制基因[5-7]。另有研究顯示，RKIP在高侵襲性宮頸癌細胞系Caski中的表達低于其他各組，認為RKIP基因與宮頸癌細胞的侵襲能力有關[7]。

為了進一步探討RKIP基因在宮頸癌發(fā)展和轉移中的作用，本研究采用脂質體轉染的方法將含有ssRKIP cDNA 的質粒導入宮頸癌Caski細胞，建立了RKIP基因表達上調的穩(wěn)定轉染細胞系，結果顯示，RKIP基因對宮頸癌細胞體外增殖、錨定非依賴性生長和侵襲能力等生物學行為均有明顯的抑制作用。體外增殖實驗及雙層軟瓊脂集落形成實驗結果顯示， RKIP基因轉染后細胞吸光度值明顯低于未轉染細胞，克隆形成數(shù)亦明顯少于未轉染細胞，說明RKIP基因表達上調能抑制Caski細胞的體外增殖和錨定非依賴性生長能力。該結果與LI等[12]對卵巢癌研究結果一致；但是與FU等[3]和SCHUIERER等[10]的研究結果不同，他們的結果顯示，RKIP基因對前列腺癌細胞和黑色素瘤細胞的體外增殖、錨定非依賴性生長能力并無影響。

腫瘤的轉移過程涉及多個步驟和環(huán)節(jié)，其中侵襲是比較重要的環(huán)節(jié)。本研究Transwell小室侵襲實驗結果顯示，RKIP基因表達上調的Caski細胞的體外侵襲能力減弱，說明RKIP基因能夠抑制宮頸癌Caski細胞的體外侵襲能力。本實驗結果與LI等[12]和FU等[3]研究結果一致。

本文研究結果還顯示，上調表達RKIP基因后的Caski細胞的體外增殖、克隆形成數(shù)及穿膜細胞數(shù)均明顯低于未轉染細胞，表明RKIP基因不僅對宮頸癌細胞侵襲轉移有抑制作用，對其生長增殖、錨定非依賴性生長能力也有抑制作用。鑒于抑制轉移過程的基因(稱為轉移抑制基因)并不抑制原初腫瘤的生長，而本文結果顯示RKIP對宮頸癌細胞的生長及侵襲均有抑制作用，因此我們初步認為，RKIP基因可能是宮頸癌的抑癌基因。

隨著RKIP基因在多種腫瘤中轉移抑制作用的不斷被發(fā)掘，其在腫瘤基因治療中的潛在價值也日趨顯現(xiàn)。最新的研究結果表明，RKIP表達上調能增強腫瘤細胞對放化療的敏感性[13-14]。RKIP表達下調與腫瘤的惡性演化具有相關性，恢復RKIP表達能夠改變其惡性侵襲和抗藥性等惡性生物學行為，這些結果都將支持RKIP作為一個重要的抗腫瘤治療靶點，并且已有Raf活性調節(jié)劑應用于臨床，其治療效果也令人鼓舞[15]。本研究觀察RKIP基因上調表達對宮頸癌細胞生物學行為的影響，結果顯示，RKIP基因與宮頸癌細胞的增殖及侵襲能力呈負相關，為宮頸癌的基因治療提供了方向和依據(jù)。但RKIP基因對于宮頸癌細胞放化療敏感性的作用尚需進一步研究。

綜上所述，RKIP基因可能并不是宮頸癌的轉移抑制基因而可能是抑癌基因。鑒于RKIP基因上調表達對宮頸癌細胞的增殖和侵襲能力具有抑制作用，RKIP基因有可能成為宮頸癌治療的新靶點。

[1] MONK B J, CHA D S, WALLKER J L, et al. Extent of di-sease as an indication for pelvic radiation following radical hysterectomy and bilateral pelvic lymph node dissection in the treatment of stage IB and IA cervical carcinoma[J]. Gynecol Oncol, 1994,54(1):4-9.

[2] AOKI Y, AASAKIM, WATANABEM, et al. High-risk group in node-positive patients with stage ⅠB, ⅡA, and ⅡB cervical carcinoma after radical hysterectomy and postoperative pelvic irradiation[J]. Gynecol Oncol, 2000,77:305-309.

[3] FU ZHENG, SMITH P C, ZHANG LIZHI, et al. Effects of raf kinase inhibitor protein expression on suppression of prostate cancer metastasis[J]. Journal of the National Cancer Institute, 2003,95(12):878-889.

[4] FU ZHENG, KITAGAWA Y, SHEN RONGLAI, et al. Metastasis suppressor gene Raf kinase inhibitor protein (RKIP) is a novel prognostic marker in prostate cancer[J]. Prostate, 2006,66(3):248-256.

[5] HU C J, ZHOU L, ZHANG J, et al. Immunohistochemical detection of Raf kinase inhibitor protein in normal cervical tissue and cervical cancer tissue[J]. The Journal of International Medical Research, 2011,39(1):229-237.

[6] 吳景麗,紀新強,李發(fā)紅. 宮頸癌組織Raf激酶抑制蛋白和NF-κB p65表達及其臨床意義[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2010,25(2):107-111.

[7] 胡春杰,周磊,黃琛,等. Raf激酶抑制蛋白在宮頸癌中的表達及其臨床意義[J]. 國際遺傳學雜志, 2011,34(5):231-236.

[8] LI H Z, GAO Y, ZHAO X L, et al. Effcet of Raf kinase inhibitor protein expresssion on metastasis and progression of human breast cancer[J]. Molecular Cancer Research, 2009,7(6):832-840.

[9] HAGAN S, AL-MULLA F, MALLON E, et al. Reduction of Raf-1 kinase inhibitor protein expression correlates with breast cancer metastasis[J]. Clinical Cancer Research: an Official Journal of the American Association for Cancer Research, 2005,11(20):7392-7397.

[10] SCHUIERER M M, BATAILLE F, HAGAN S, et al. Reduction in Raf kinase inhibitor protein expression is associated with increased Ras-extracellular signal-regulated kinase signaling in melanoma cell lines[J]. Cancer Research, 2004,64(15):5186-5192.

[11] PARK S, YEUNG M L, BEACH S, et al. RKIP downregulates B-Raf kinase activity in melanoma cancer cells[J]. Oncogene, 2005,24(21):3535-3540.

[12] LI H Z, WANG Y, GAO Y, et al. Effects of raf kinase inhibitor protein expression on metastasis and progression of human epithelial ovarian cancer[J]. Molecular Cancer Research, 2008,6(6):917-928.

[13] CHATTERJEE D, BAI Y, WANG Z, et al. RKIP sensitizes prostate and breast cancer cells to drug-induced apoptosis[J]. Journal of Biological Chemistry, 2004,279(17):17515-17523.

[14] 宋繼文,高燕,林璨璨,等. Raf激酶抑制蛋白增強卵巢癌細胞的化療敏感性[J]. 中國腫瘤生物治療雜志, 2010,17(2):155-160.

[15] 陸嘉德,郭曄. 腫瘤靶向治療新探:多靶點Raf激酶抑制劑[J]. 中國癌癥雜志, 2007,17(1):1-7.