肝癌病人癌組織與血漿p16及APC基因甲基化檢測及意義

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(青島大學醫(yī)學院營養(yǎng)研究所，山東 青島 266021)

原發(fā)性肝癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，而在臨床上80%～90%的肝癌病例為肝細胞性肝癌(HCC)。HCC的發(fā)生是一個多因素、多階段的復雜過程，其發(fā)病的分子機制尚不清楚。研究表明，HCC的發(fā)生不僅與基因突變有關(guān)，抑癌基因啟動子區(qū)CpG序列異常甲基化導致的基因失活也是肝癌發(fā)生的一個重要途徑[1-3]。多腫瘤抑制因子p16和結(jié)腸腺瘤樣息肉基因(APC)是兩個重要的腫瘤抑制基因，其中p16基因是細胞周期的負調(diào)控因子[1]，APC基因可控制細胞分裂過程中起關(guān)鍵作用的基因的表達[4]。已有研究結(jié)果顯示，肝癌、胃癌等多種腫瘤組織及血漿標本中p16、APC基因的啟動子區(qū)域CpG島常發(fā)生異常甲基化[2,5-6]，但不同研究者報道的p16、APC基因甲基化在肝癌組織及血漿標本的檢出率有一定差異，特別是基因甲基化在癌組織與對應血漿標本表達的情況存在較大差異。本研究采用實時熒光PCR技術(shù)測定86例病人HCC組織及相應癌旁正常組織、血漿中p16、APC基因啟動子區(qū)CpG島甲基化情況，分析p16、APC基因甲基化在癌組織與血漿標本檢出情況及其與HCC病人臨床特征關(guān)系，并探討其臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取2008年6月—2009年6月于青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院行外科切除術(shù)的HCC病人標本86例，男69例，女17例；以24例正常人及良性肝病病人正常肝組織作為對照。全部病例均經(jīng)組織病理學檢查證實，根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟(UICC)分期標準對HCC進行分期。

1.2 標本的獲取

術(shù)前采集受檢者外周靜脈血5 mL，2 h內(nèi)離心分別取血漿和血細胞置于1.5 mL塑料離心管中；病人手術(shù)時收集HCC組織及相應的癌旁正常組織(取自距癌灶邊緣3～5 cm外觀正常的組織，均避開壞死、炎癥部位，編號與外周血標本對應)標本。所有標本獲取經(jīng)青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會批準，病人或家屬知情同意。

1.3 肝癌組織、癌旁正常組織和血漿標本DNA的抽提

使用組織基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit)按照試劑盒說明，進行組織DNA的抽提；采用酚氯仿法進行外周血標本DNA的抽提。

1.4 p16、APC甲基化檢測

1.4.1DNA修飾 取15 μL DNA，加入5 μL M-2Dilution Buffer混勻，去離子水補足50 μL，37 ℃水浴15 min。根據(jù)試劑盒說明的要求，將DNA進行亞硫酸氫鈉修飾及純化，最終溶于40 μL TE溶液,-20 ℃保存。

1.4.2PCR檢測p16、APC甲基化狀態(tài) 引物序列見表1。PCR擴增反應體系10 μL：包括亞硫酸氫鈉修飾的模板1 μL(25 ng)，200 nmol/L的引物各0.5 μL， 2× Epitect HRM Master Mix(HotStarTaq 酶、DNA 聚合酶、EpiTect HRM PCR Buffer)5 μL，以去離子水補足至10 μL。擴增條件：95 ℃預變性 20 s，然后以適宜的溫度退火30 s，72 ℃退火40 s、95 ℃退火1 min，進行50個循環(huán)，再95 ℃延伸1 min，最后20 ℃終止反應。PCR 擴增結(jié)束后，在PCR儀上直接進行高分辨熔解。對PCR產(chǎn)物以0.2 ℃/s的速度行55～90 ℃熔解曲線分析，通過分析熔解曲線直接判定甲基化情況。

1.5 統(tǒng)計分析

應用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，癌組織、癌旁正常組織和對應血漿之間甲基化率比較采用χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1 p16和APC基因甲基化情況比較

本文24例正常肝組織未檢出p16和APC基因的異常甲基化。癌組織p16基因甲基化率明顯高于癌旁正常組織和對應的血漿標本(χ2=67.48、6.72，P<0.05)。癌組織中APC基因甲基化率也均明顯高于癌旁正常組織和對應的血漿標本(χ2=18.03、29.16，P<0.05)。肝癌組織及對應血漿標本p16、APC基因甲基化的一致率分別為65.4%、43.3%。見表2。

表1 甲基化特異性引物序列

表2 癌組織、癌旁組織及血漿標本中基因甲基化率的比較(例(χ%))

2.2 癌組織及對應血漿標本基因甲基化率與臨床特征的關(guān)系

癌組織及對應血漿標本p16和APC基因甲基化率與病人年齡、性別、吸煙狀況、飲酒狀況、TNM分期、腫瘤大小以及甲胎蛋白(AFP)水平無相關(guān)性(P>0.05)。HBsAg陽性組病人肝癌組織及對應血漿標本p16基因甲基化率顯著高于HBsAg陰性組(χ2=5.60、5.67，P<0.05)。見表3。

3 討 論

DNA甲基化是一種常見的表觀遺傳修飾形式，在調(diào)節(jié)基因表達及維持細胞正常分化中起著重要作用，并與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[7]。已有研究結(jié)果顯示，人類腫瘤組織和腫瘤細胞中眾多癌相關(guān)基因啟動子區(qū)CpG島存在高甲基化現(xiàn)象，如抑癌基因、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因、DNA修復基因等[1,4,7]。

p16和APC基因是兩個重要的多腫瘤抑制基因，其中p16基因產(chǎn)物是細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制因子[1]，APC基因產(chǎn)物是Wnt信號傳導途徑的重要組成部分，可控制細胞分裂過程中起關(guān)鍵作用的基因的表達[4]。目前，國內(nèi)外已有大量有關(guān)p16和APC基因在腫瘤組織及血漿中異常甲基化檢測的研究報道，但結(jié)果仍存在一定差異。LOU等[8]研究結(jié)果顯示，肝癌組織p16基因啟動子區(qū)甲基化頻率顯著高于癌旁組織，而蔣磊等[9]研究結(jié)果則顯示，肝癌組織中p16基因異常甲基化率僅為30%(12/40)。同樣吳龍等[10]的研究結(jié)果顯示，肝癌組織APC基因甲基化率顯著高于癌旁及正常對照肝組織，認為是APC基因甲基化參與了肝癌的形成。而YU等[11]報道，在肝癌組織、癌旁組織和正常肝組織中均未檢測到APC基因甲基化，進而推測APC基因甲基化可能在肝癌形成過程中不發(fā)揮作用。不同研究者結(jié)論不一致的原因可能與研究對象的例數(shù)、甲基化的檢測方法不同等有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，86例HCC組織p16和APC基因的甲基化頻率顯著高于相應癌旁組織和血漿標本，且差異有顯著性，這與LOU等[8]和吳龍等[10]的研究結(jié)果一致，提示抑癌基因甲基化可能是肝癌發(fā)生、發(fā)展的一個重要因素。

表3 肝癌病人p16、APC啟動子區(qū)甲基化與臨床特征的關(guān)系(例(χ%))

肝癌的發(fā)生是一個多因素、多步驟的過程，與多種致病因素有關(guān)，因此我們分析了癌組織與對應血漿標本中p16、APC基因甲基化狀態(tài)與年齡、性別、HBV感染、TNM分期、腫瘤大小等臨床特征的關(guān)系，結(jié)果顯示，HBsAg陽性者肝癌組織及其對應血漿p16基因啟動子區(qū)甲基化頻率分別為66.2%和46.5%，顯著高于HBsAg陰性者，提示基因甲基化與HBV感染關(guān)系密切，其可能是導致HCC發(fā)生的一個重要因素[12]。另外，本研究結(jié)果還顯示，p16、APC基因甲基化狀態(tài)與TNM分期、腫瘤大小無關(guān)，提示兩種基因的失活可能均發(fā)生于癌變的初始階段。

由于癌組織的檢測在取材和檢測等方面存在操作不方便、難度較大、易給病人造成痛苦和創(chuàng)傷等問題，所以本研究同時檢測了血漿中p16、APC基因啟動子區(qū)的甲基化狀態(tài)。結(jié)果顯示，癌組織和血漿標本p16基因啟動子區(qū)甲基化的一致率為65.4%，血漿p16基因啟動子區(qū)甲基化頻率顯著高于癌旁組織，提示檢測血漿p16基因啟動子區(qū)甲基化在肝癌早期診斷方面可能具有輔助價值。然而，血漿標本中APC基因啟動子區(qū)甲基化頻率與癌旁正常組織差異無顯著性，其在肝癌早期診斷方面能否作為非侵入性腫瘤診斷輔助方法有待進一步研究。

總之，肝癌組織中p16、APC基因處于高甲基化狀態(tài)，此種狀態(tài)可能是肝癌發(fā)生過程中一個重要因素。研究肝癌病人特異性基因甲基化的狀態(tài)，有助于我們更深入地認識基因甲基化在肝癌發(fā)生發(fā)展中所起的作用，為肝癌的預防、早期診斷及治療提供科學的理論依據(jù)。

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