不同器具煎煮補陽還五湯的4種成分含量比較

張星，陸兔林，毛春芹，蔡寶昌，顧娟娟，弓曉東，胡俊揚，吳楊 （.南京中醫(yī)藥大學江蘇省中藥炮制重點實驗室，江蘇 南京0046；.南京中醫(yī)藥大學藥學院，江蘇 南京0046）

補陽還五湯出自《醫(yī)林改錯》下卷，由清代名醫(yī)王清任所創(chuàng)制［1］，由生黃芪、當歸尾、赤芍、川芎、桃仁、地龍、紅花組成，具有補氣活血、化淤通絡之功效，主要用于治療半身不遂，遺尿不禁等氣虛血淤證，是臨床治療老年中風癥常用經驗方劑。眾所周知，中藥的煎煮方法及煎藥器具直接影響中藥的質量及療效。目前，市場上有關湯劑煎煮的器具種類繁多，比如砂鍋、搪瓷鍋、不銹鋼鍋等，甚至有人仍使用鋁鍋或鐵鍋煎煮中藥，致使藥物療效降低，因為鋁、鐵、銅的金屬活性較強，很可能與中藥中的某些成分起化學反應，這種化學反應可使藥物中的某些有效成分發(fā)生沉淀，生成對人體有害的物質［2］。傳統(tǒng)煎藥一般通用的是有蓋的陶瓷砂鍋，還有部分人使用全自動煎藥壺及不銹鋼鍋等。本實驗以測定不同器具煎煮的補陽還五湯中多成分含量評價各個煎煮器具的優(yōu)劣，優(yōu)選最佳的煎煮器具，為臨床湯劑煎煮規(guī)范提供可靠依據(jù)。

現(xiàn)有文獻報道該方的主要活性成分包括黃酮類、揮發(fā)油及多糖等［3］，其中以黃芪中的黃酮類成分含量較高，如毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素等，且黃酮類成分具有抗心肌缺血、抗炎、清除自由基等藥理作用［4］，桃仁中的苦杏仁苷具有活血祛淤之功［5－7］，赤芍中的芍藥苷有鎮(zhèn)靜、抗過敏、血管擴張等藥理作用［8－10］。本文建立了用HPLC同時檢測補陽還五湯中苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素4種有效成分含量的方法［11－13］，并應用該法評價優(yōu)選補陽還五湯最佳煎煮器具，為補陽還五湯臨床煎煮應用提供了可靠依據(jù)，從而更加全面、有效的控制其質量，保證其療效。

1 材料

Agilent 1100高效液相色譜儀；KQ－500B 型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；FA1104型萬分之一電子分析天平（上海天平儀器廠）；HH－S型水浴鍋（鞏義市英峪予華儀器廠）；砂鍋（景德鎮(zhèn)嘉寶瓷業(yè)發(fā)展有限公司）；不銹鋼鍋（美的集團有限公司）；全自動中藥壺（廣東潮州奇巧貿易有限公司）。

苦杏仁苷對照品（批號820－200002）、芍藥苷對照品（批號110736－201035）、芒柄花素對照品（批號111703－200501）均購自中國食品藥品檢定研究院；毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（批號110796－201017，購自上海源葉生物科技有限公司，純度均大于99%）；補陽還五湯的樣品和陰性樣品均自制；黃芪、當歸、赤芍、紅花、川芎、桃仁、地龍均購自江蘇海昌中藥飲片有限公司，經南京中醫(yī)藥大學藥學院陳建偉教授鑒定，符合中國藥典2010 年版一部相關規(guī)定，均為正品飲片；乙腈（美國Tedia公司）、甲醇（上海凌峰化學試劑公司）為色譜純，水為二次重蒸水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件及系統(tǒng)試用性試驗 采用依利特Hypersil ODS2色譜柱（250mm×4.6mm，5μm），乙腈（A）－0.1%磷酸水溶液（B）為流動相，梯度洗脫，具體梯度見表1，流速為1mL·min－1，檢測波長為218nm，柱溫為30℃，進樣量10μL，分析時間為80min。

表1 梯度洗脫順序Tab 1 Gradient elution of mobile phase

2.2 對照品溶液的制備 分別稱取苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素對照品適量，加甲醇配制成每1mL 分別含苦杏仁苷0.938 mg、芍藥苷0.977 mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.864 mg、芒柄花素0.44mg的單個組分對照品溶液。

分別精密量取上述單個組分對照品溶液至10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，配成每1mL 分別含苦杏仁苷0.187 6mg、芍藥苷0.195 4mg、毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.172 8mg及芒柄花素0.088mg的混合對照品液。

2.3 供試品溶液的制備 分別取補陽還五湯一劑處方量的飲片（黃芪120g，當歸6g，赤芍5g，川芎、紅花、桃仁、地龍各3g）于砂鍋、不銹鋼鍋、全自動中藥壺中加相當于飲片10倍量的水，浸泡30min，砂鍋、不銹鋼鍋明火加熱煎煮30 min，全自動中藥壺無明火加熱煎煮30min，各煎煮2次（2次加水比例6∶4），兩層紗布過濾，合并濾液，濃縮，定容至300 mL。實驗平行操作5次。

精密量取補陽還五湯濃縮液20mL，水浴蒸干，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25mL，密塞，稱定，超聲處理30 min，取出，放冷至室溫，稱定，加甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液，過0.45μm 的微孔濾膜。

2.4 陰性對照溶液的配制 按處方比例分別稱取除黃芪、赤芍、桃仁以外的其余藥味，按“2.3”項下供試品溶液的制備方法操作制成缺黃芪、缺赤芍、缺桃仁的陰性對照溶液。

2.5 專屬性試驗 分別取混合對照品溶液，供試品溶液及陰性對照溶液，按上述色譜條件進樣分析，液相色譜圖見圖1。陰性樣品在指標成分苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素的色譜峰位置上無吸收，表明該方法的專屬性良好。

圖1 補陽還五湯的HPLC色譜圖A.混合對照品；B.補陽還五湯樣品；C.陰性樣品；1－苦杏仁苷；2－芍藥苷；3－毛蕊異黃酮葡萄糖苷；4－芒柄花素Fig 1 HPLC chromatograms of Buyang Huanwu decoctionA.mixed reference substance；B.samples；C.negative sample；1－amygdalin；2－paeoniflorin；3－calycosin glucoside；4－Formononetin

2.6 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液0.2，0.5，1，2.5，5 mL 至5 mL 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，分別進樣分析，進樣量10 μL 記錄峰面積。以峰面積Y 對進樣量X（mg·mL－1）進行線性回歸，求得苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素的回歸方程、相關系數(shù)和線性范圍，結果見表2。

表2 4種有效成分的線性方程、相關系數(shù)及線性范圍Tab 2 Regression equation，correlation coefficient and linearity range of 4compounds

結果表明，苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素的含量分別在0.007 5～0.187 6 mg·mL－1、0.007 8～0.195 4mg·mL－1、0.006 9～0.172 8mg·mL－1、0.003 5～0.088 0mg·mL－1范圍內與峰面積呈良好的線性關系。

2.7 精密度試驗 取上述對照品溶液，在上述色譜條件下連續(xù)進樣6次，記錄苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素峰面積，并計算其RSD分別為0.95%，0.84%，1.09%，1.62%，結果表明儀器精密度良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗 精密量取砂鍋煎煮的補陽還五湯樣品1份，按照供試品溶液的制備方法制備供試品溶液，分別在0，2，4，8，12，20h測定樣品中各組分的峰面積，計算苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素峰面積的RSD 分別為0.75%，1.34%，2.02%，1.78%，表明供試品溶液在20h內穩(wěn)定。

表3 不同器具煎煮對補陽還五湯4種成分的含量的影響（mg·g－1，n＝5）Tab 3 Influence of different boiling apparatus on the contents of the four ingredients of Buyang Huanwu decoction（n＝5）

2.9 重復性試驗 精密量取砂鍋煎煮的補陽還五湯樣品6份，按“2.3”項下方法制備供試品液，進樣10μL，記錄峰面積，并計算含量。結果樣品中苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素平均含 量 分 別 為7.7869，4.503，0.4996，0.0782 mg·g－1，RSD 分別為0.62%，0.17%，0.62%，0.10%，表明該方法重復性良好。

2.10 準確度試驗 精密量取砂鍋煎煮的補陽還五湯樣品9份，每份10mL，置具塞錐形瓶中，水浴蒸干，根據(jù)樣品中苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷及芒柄花素含有量的80%，100%，120%，分別加入混合對照品溶液（含苦杏仁苷0.667 4 mg·mL－1、芍藥苷0.349 8 mg·mL－1、毛蕊異黃酮葡萄糖 苷1.328 7 mg·mL－1、芒 柄 花 素0.126 5 mg·mL－1）0.8，1，1.2mL，各3份，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進樣測定，計算加樣回收率。結果苦杏仁苷、芍藥苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、芒柄花素的平 均 回 收 率 分 別 為99.35%，98.75%，101.65%，101.63%，RSD 分 別 為0.21%，0.24%，1.03%，0.62%。

2.11 樣品含量測定 取3種不同器具煎煮的的補陽還五湯共15份（每種平行5份），按“2.3”項下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定含量，以一劑處方生藥總量計算，結果見表3。

由表3經過t檢驗可見，砂鍋煎煮組補陽還五湯藥液中4種成分含量均與不銹鋼鍋組及全自動中藥壺組有顯著性差異（P＜0.01），說明使用傳統(tǒng)砂鍋煎煮補陽還五湯最佳；而不銹鋼煎煮組與全自動中藥壺組差異也具有顯著性（P＜0.01），說明使用不銹鋼煎煮補陽還五湯有效成分含量最低。

3 討論

補陽還五湯成分復雜，其主要有效成分的紫外吸收差異很大，通過HPLC 在210，218，230，260，300nm 波長下檢測，結果表明在218nm 處有被測各種成分均能出峰，260nm 以上芍藥苷被測靈敏度大大降低，苦杏仁苷基本檢測不出。為使各組分在同一波長下都能有較好吸收，達到吸收強、干擾小的目的，故選擇218nm，從而實現(xiàn)對4個成分的同時測定，以全面評價湯劑的質量。

本文通過同時測定補陽還五湯中4種有效成分的含量優(yōu)選其最佳煎煮器具，得出砂鍋效果最好。造成如此結果的原因可能是砂鍋煎煮中藥是使用明火加熱，受熱均勻，升溫速度相對較慢，煎出藥液性質穩(wěn)定且煎汁較濃，故有效成分含量較高；全自動中藥壺雖然也是搪瓷制品，但是屬于無明火加熱，受熱不均；而使用不銹鋼鍋煎煮中藥，因為是金屬質地，所以升溫速度過快，飲片受熱不均，煎汁色澤較淡且性質不穩(wěn)，故所測有效成分含量最低。

本實驗研究得出采用傳統(tǒng)砂鍋煎煮補陽還五湯有效成分含量最高。煎煮器具對中藥湯劑質量及療效的影響目前研究還屬于初步階段，本實驗為其進一步研究提供了可靠地理論依據(jù)，同時也為臨床湯劑煎煮技術的規(guī)范化提供了有力的科學參考。

［1］ 周祥龍.實用中藥方劑學［M］.濟南：山東大學出版社，2005：6.

［2］ 張學慧，徐國文.中藥煎煮方法淺析［J］.中國民族民間醫(yī)藥，2009，7（12）：118.

［3］ 閻小萍.近10年補陽還五湯實驗研究概況［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，1999，6（6）：16－17.

［4］ 馬曉豐，田曉明，陳英杰，等.蒙古黃芪中黃酮類成分的研究.中成藥，2005，36（9）：1293－1296.

［5］ 楊小平，張春梅，馮霞，等.苦杏仁苷口服制劑臨床療效初探［J］.中藥材，2006，29（6）：636－637.

［6］ 楊曉宇，陳錦屏.杏仁的營養(yǎng)保健功能及其在食品工業(yè)中的應用［J］.食品科學，2005，26（9）：629－631.

［7］ 方偉蓉，李運曼，鐘林霖.苦杏仁苷對佐劑性炎癥影響的實驗研究［J］.中國臨床藥理學與治療學，2004，9（3）：289－292.

［8］ 陳廣斌，陳華萍，吳鐵，等.芍藥苷對缺氧缺血性腦損傷新生大鼠腦組織丙二醛、超氧化物歧化酶的影響［J］.實用兒科臨床雜志，2008，23（16）：578－579.

［9］ 王君萍，韋穎梅，郭梅，等.芍藥苷對大鼠腦缺血再灌注損傷細胞凋亡相關基因的影響［J］.中西醫(yī)結合心腦血管病雜志，2008，6（3）：623－625.

［10］孫蓉，呂麗莉，劉國卿.芍藥苷對沙土鼠不全性腦缺血后能量代謝、NO 和NOS的影響［J］.中國中藥雜志，2006，52（10）：667－670.

［11］萬日義，劉錫鈞.黃芪及其制劑中有效成分鑒別和含量測定研究概述［J］.海峽藥學，1998，10（1）：7.

［12］趙耀.桃仁中苦杏仁苷的HPLC含量測定［J］.中國醫(yī)藥指南，2009，7（17）：84－85.

［13］徐偉雄.RP－HPLC法測定不同產地赤芍中芍藥苷的含量［J］.中國中醫(yī)藥信息雜志，2004，11（9）：797－798.