效應面法優(yōu)化活血消癭片中揮發(fā)油的包合工藝

胡俊杰，肖伊，王桂紅，鄭國華 （.湖北中醫(yī)藥大學，湖北 武漢430065；.孝感市孝南區(qū)食品藥品監(jiān)督管理局，湖北孝感43000）

活血消癭片是根據(jù)湖北中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院陳如泉教授的臨床經(jīng)驗方，自主研發(fā)而成的中藥復方制劑，具有活血通絡、消癭化結(jié)之功效，臨床上主要用于治療結(jié)節(jié)性甲狀腺腫［1］。處方由桃仁、莪術(shù)、柴胡等8味中藥組成，其中，莪術(shù)、柴胡均含有揮發(fā)油，且是主要活性成分［2－4］。為將該制劑開發(fā)成現(xiàn)代中成藥，減少揮發(fā)油損失，增加其在制劑生產(chǎn)和貯存過程中的穩(wěn)定性，保證藥效，本研究利用β－環(huán)糊精對揮發(fā)油進行包合。

目前，國內(nèi)數(shù)理統(tǒng)計往往采用正交設計或均勻設計［5］，尋求最佳的因素水平組合，但不能在給出的整個區(qū)域上找到因素和響應值之間的一個明確的函數(shù)表達式，從而無法找到整個區(qū)域上的因素的最佳組合和響應的最優(yōu)值。Box－Behnken效應面法是統(tǒng)計設計試驗技術(shù)的合成，利用Box－Behnken 的試驗設計并通過試驗得到一定數(shù)據(jù)，采用多元二次方程來擬合因素和效應值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)，解決多變量問題的一種統(tǒng)計方法［6］。本實驗采用采用單因素試驗結(jié)合Box－Behnken效應面法優(yōu)選活血消癭片中揮發(fā)油的最佳包合工藝條件。

1 材料

Mettler－Toledo AG285 型 分 析 天 平（Mettler－ToledoGmbH，Laboratory ＆ Weighing Technologies，Switzerland）；無水乙醇為分析純，水為自制重蒸水；β－環(huán)糊精（國藥集團化學試劑有限公司，批號F20100614）；揮發(fā)油提取制備工藝：按處方比例取莪術(shù)、柴胡兩味藥材，補足其1倍吸水量后，加入8倍量的水浸泡3h，運用中國藥典2010年版一部附錄XD 方法提取揮發(fā)油6h，用無水乙醇萃取，取乙醇層用無水硫酸鈉干燥過夜，濾去無水硫酸鈉，揮去乙醇，得揮發(fā)油備用。處方中各藥材購自湖北天濟中藥飲片有限公司，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學生藥教研室陳科力教授鑒定均為正品。

2 方法與結(jié)果

2.1 評價指標 篩選指標：包合率。

揮發(fā)油的包合率＝包合物中實際含油量（mL）／［揮發(fā)油投入量（mL）×空白回收率］×100%

揮發(fā)油空白回收率＝收集揮發(fā)油的量／加入揮發(fā)油的量×100%

揮發(fā)油空白回收率測定：精密量取揮發(fā)油1.0 mL置于500mL圓底燒瓶中，加入純化水250mL，按中國藥典2010年版一部附錄揮發(fā)油測定法甲法［5］測定揮發(fā)油量，經(jīng)3次測定，計算空白回收率為95%。

2.2 包合方法的選擇［8］通過預試驗和結(jié)合文獻，本實驗主要對飽和水溶液法和超聲法進行比較研究。

2.2.1 飽和水溶液法 取1mL揮發(fā)油，用4mL無水乙醇溶解。稱取6gβ－環(huán)糊精，置150mL具塞錐形瓶中，加100mL的純化水，水浴加熱使溶解，自然冷卻至50℃，置控溫磁力攪拌器上邊攪拌邊滴加揮發(fā)油乙醇溶液，加塞繼續(xù)攪拌1h，平行操作3次。

2.2.2 超聲法 取1mL 揮發(fā)油，用4mL 無水乙醇溶解。稱取6gβ－環(huán)糊精，置150mL具塞錐形瓶中，加100mL的純化水，水浴加熱使溶解，自然冷卻至50 ℃，置50kHz超聲清洗儀中邊超聲邊滴加揮發(fā)油乙醇溶液，加塞繼續(xù)超聲1h，平行操作3次。

2.2.3 包合物的制備及揮發(fā)油的測定 分別將上述2種方法制得的包合物溶液置冰箱中，冷藏12h，抽濾，少量水洗，抽至近干，再無水乙醇洗滌至無揮發(fā)油氣味，干燥，即得β－環(huán)糊精 包合物。將制得的包合物置于500 mL 圓底燒瓶中，加入純化水250 mL，測定揮發(fā)油量。

2.2.4 包合方法的選擇試驗結(jié)果 采用超聲法和飽和水溶液法包合工藝所得的揮發(fā)油平均包合率分別為57.05%和63.16%。飽和水溶液法的包合效果較好，因此采用飽和水溶液法進行包合。

2.3 單因素試驗初步優(yōu)化飽和水溶液法包合工藝

2.3.1 β－環(huán)糊精加入量對包合工藝的影響 固定包合溫度為50 ℃，包合時間為1h，以揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）的量對揮發(fā)油包合率的影響進行單因素試驗。設計揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶2，1∶4，1∶6，1∶8，1∶10，結(jié)果見圖1。

圖1 β－環(huán)糊精加入量對包合工藝的影響（n＝3）Fig 1 Effects ofβ－CD addition amount on inclusion process（n＝3）

由圖1可知，揮發(fā)油－β－環(huán)糊精在1∶2～1∶6之間時，隨著β－環(huán)糊精加入量的增加，揮發(fā)油包合率增加顯著；當揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶6時揮發(fā)油包合率達到最高值，后期趨于平緩。因此，選擇揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）在1∶4～1∶8之間。

2.3.2 包合時間對包合工藝的影響 固定揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶6，包合溫度為50 ℃，以包合時間對揮發(fā)油包合率的影響進行單因素試驗。設計包合時間分別為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0h，結(jié)果見圖2。

圖2 包合時間對包合工藝的影響（n＝3）Fig 2 Effects of inclusion time on inclusion process（n＝3）

由圖2可知，隨著包合時間的延長，揮發(fā)油包合率提高，包合時間為2h時，包合率達到最高值。再延長包合時間，包合率有下降趨勢。因此，包合時間應在1.5～2.5h之間。

2.3.3 包合溫度對包合工藝的影響 固定揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）為1∶6，包合時間為2h，以包合溫度對揮發(fā)油包合率的影響進行單因素試驗。設計包合溫度分別為30，40，50，60，70 ℃，結(jié)果見圖3。

圖3 包合溫度對包合工藝的影響（n＝3）Fig 3 Effects of inclusion temperature on inclusion process（n＝3）

由圖3可知，隨著包合溫度的升高，在30～50℃之間，揮發(fā)油包合率顯著提高，包合溫度為50 ℃時，包合率達到最高值。再升高包合溫度，包合率反而下降。這可能是因為包合溫度的不斷升高，使部分揮發(fā)油揮發(fā)，從而使包合率下降。因此，包合溫度應在40～50 ℃之間。

2.4 響應面法優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝［11－13］

2.4.1 響應面分析 采用軟件Design Excerpt 7.0.0中的Box－Behnken 試驗設計原理，綜合單因素試驗結(jié)果，設計三因素三水平試驗設計表1。三因素分別是揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（mL∶g）（A）、包合時間（B）、包合溫度（C）。

表1 Box－Behnken試驗設計因素和水平Tab 1 Factors and levels of Box－Behnken design test

2.4.2 響應面法優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝 以A、B、C為自變量，揮發(fā)油包合率Y 為響應值（%），響應面分析方案及結(jié)果見表2。

2.4.3 模型的建立及顯著性檢驗 用ANOVA 分析響應面的回歸參數(shù)。由表3可知，A、A2、B2、C2項達到極顯著水平（P＜0.01）。C、AB 項達到顯著水平（P＜0.05）。

利用Design－Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到揮發(fā)油包合率對揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（A）、包合時間（B）和包合溫度（C）的二次多項回歸模型：

表2 響應面分析方案及結(jié)果Tab 2 Results of response surface analysis programme

式中，——Y 為揮發(fā)油包合率（%），A為揮發(fā)油－β－環(huán)糊精（g∶mL），B為包合時間（h），C為包合溫度（℃）。

該方程的相關(guān)系數(shù)R＝0.985 1。由表3方差分析結(jié)果可知，整體模型P＜0.01，方程模型達到極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，因此二次模型成立，應用此方程可以預測揮發(fā)油的包合率及優(yōu)化飽和水溶液法包合揮發(fā)油工藝。

表3 響應面二次回歸方程方差分析結(jié)果Tab 3 Results of variance analysis of response surface quadratic regression equation

2.5 包合工藝的響應面分析與優(yōu)化 用Design－Expert軟件，根據(jù)回歸方程分析作響應面圖4～6，圖4顯示在包合溫度50 ℃條件下，包合率隨揮發(fā)油－β－環(huán)糊精和包合時間的增加先迅速增大后緩慢減小，由此可見適當?shù)脑龃髶]發(fā)油－β－環(huán)糊精和包合時間，可以一定程度的提高包合率。圖5顯示在包合時間2h條件下，包合率隨包合溫度的增大先增加后減小，包合率隨揮發(fā)油－β－環(huán)糊精的增加先迅速增大后緩慢減小。圖6顯示在揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6條件下，包合率隨包合溫度的增大先增加后減小，包合率隨包合時間的增加先迅速增大后緩慢減小，因此，在實際生產(chǎn)中應慎重控制包合溫度，以獲得較高的包合率。

圖4 揮發(fā)油－β－環(huán)糊精與包合時間對包合率影響的效應面Fig 4 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

圖5 揮發(fā)油－β－環(huán)糊精與包合溫度對包合率影響的效應面Fig 5 Response surface plot for the effect ofβ－CD：volatile oil and inclusion temperature on response value of volatile oil inclusion rate

圖6 包合溫度與包合時間對包合率影響的效應面Fig 6 Response surface plot for the effect of inclusion temperature and inclusion time on response value of volatile oil inclusion rate

2.6 揮發(fā)油包合工藝條件 結(jié)合二次回歸模型的數(shù)學分析結(jié)果，利用Design－Expert軟件對二次回歸方程求解，得最佳工藝條件為：揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6.8，包合時間2.2h，包合溫度46.95 ℃，在此條件下?lián)]發(fā)油的包合率可達82.23%。考慮到試驗操作的可行性，將包合工藝的最佳條件修正為：揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6.8，包合時間2.2h，包合溫度47℃，在此條件下進行3次驗證試驗。

驗證試驗結(jié)果表明，揮發(fā)油包合率基本穩(wěn)定，包合率的均值（82.11%）與包合率的預測值（82.23%）的相對誤差很小，證明包合工藝合理、可行。

3 討論

本實驗通過對超聲法、飽和水溶液法2種包合方法進行比較研究，確定飽和水溶液法為較好的包合方法。然后采用單因素實驗初步優(yōu)化β－CD 加入量、包合時間、包合溫度對包合工藝的影響，再用Box－Behnken響應面法優(yōu)化揮發(fā)油的包合工藝，得出的最優(yōu)飽和水溶液包合工藝條件為：揮發(fā)油－β－環(huán)糊精為1∶6.8，包合時間2.2h，包合溫度47 ℃。揮發(fā)油的包合率為82.11%，包合率的均值（82.11%）與包合率的預測值（82.234%）的相對誤差很小，證明包合工藝合理、可行。

目前，國內(nèi)關(guān)于揮發(fā)油的包合工藝研究多采用正交設計、均勻設計試驗，這些實驗是建立在線性模型的基礎上，只能對一個個孤立的實驗點進行分析，實驗精確度不高，預測性較差；而效應面法采用多元非線性擬合、二項式回歸分析，囊括了實驗設計、建模、檢驗模型的合適性、尋求最佳組合條件等眾多試驗和統(tǒng)計技術(shù)，擬合預測能力優(yōu)異可靠，該方法應用于揮發(fā)油包合工藝及中藥制備工藝的優(yōu)選，有較好的應用前景。

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