簡單快速的多糖植物雙生病毒核酸提取方法

郭靈芳，張長青，魯紅學(xué)，孫正祥，章松柏，張友軍，吳祖建

（1.長江大學(xué)工程技術(shù)學(xué)院，湖北荊州 434020；2.長江大學(xué)農(nóng)學(xué)院，湖北荊州 434025；3.福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所，福建福州 350002；4.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

1 雙生病毒

雙生病毒（geminiviruse）是植物病毒中唯一的一類具有孿生顆粒形態(tài)的單鏈環(huán)狀DNA 病毒，病毒粒子的大小約為18nm×30nm，無包膜，基因組為單組分或雙組分結(jié)構(gòu)，大小為2.5～3.0kb，通常由昆蟲介體以持久性方式傳播，大多侵染寄主植物的韌皮部組織［1－3］。雙生病毒一般發(fā)生在熱帶、亞熱帶地區(qū)，溫帶地區(qū)也偶有發(fā)生。20世紀(jì)90年代后該病毒在世界范圍內(nèi)大面積爆發(fā)，并在多種重要作物上引起嚴(yán)重危害，其中番茄、木薯、棉花和煙草是遭受雙生病毒危害最嚴(yán)重的作物，給種植者造成巨大經(jīng)濟(jì)損失［4］。20世紀(jì)90年代以前，雙生病毒引起的病害在我國發(fā)生范圍小、危害不大。但90年代以后，廣西、云南等地相繼發(fā)現(xiàn)煙草、番茄、南瓜和番木瓜等作物遭受雙生病毒危害，并且發(fā)生范圍逐年擴(kuò)大，危害程度日益加深，如:廣西的番木瓜和番茄發(fā)病普遍，發(fā)病嚴(yán)重地區(qū)病株率高達(dá)30%～50%［5－8］；2006年上海和浙江先后發(fā)現(xiàn)雙生病毒危害番茄后，該病害在華東地區(qū)迅速蔓延開來，造成嚴(yán)重危害［9］。

隨著雙生病毒危害的加重，快速檢測和鑒定病原十分必要。目前應(yīng)用于雙生病毒的檢測手段主要有血清學(xué)方法、核酸雜交、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、RCA（rolling circle amplifieation）等方法。盡管已經(jīng)得到了一些雙生病毒的多克隆抗體或單克隆抗體，但由于雙生病毒血清關(guān)系有遠(yuǎn)有近，限制了血清學(xué)方法的應(yīng)用［10］。核酸雜交、PCR、RCA 3種方法都基于雙生病毒基因組核酸的方法，比較特異和靈敏，廣泛應(yīng)用于雙生病毒的檢測和鑒定。雙生病毒基因組核酸的提取質(zhì)量對檢測結(jié)果影響很大，特別是從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質(zhì)的植物中提取的雙生病毒基因組核酸。從這些植物中分離出的DNA 由于多酚被氧化成棕褐色，多糖、單寧等物質(zhì)與DNA 會結(jié)合成黏稠的膠狀物，獲得的DNA 常出現(xiàn)產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解等問題，影響DNA 質(zhì)量和純度，不能被限制性內(nèi)切酶酶切，嚴(yán)重的甚至不能作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增［11－13］。此外，雙生病毒基因組是單鏈環(huán)狀的DNA，在大小和性質(zhì)上都與寄主基因組DNA 不同，完全用植物基因組DNA 的提取方法提取雙生病毒基因組，可能會對其產(chǎn)率有一定的影響?；诖?，在傳統(tǒng)雙生病毒基因核酸提取方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合總DNA 提取的CTAB 法和質(zhì)粒提取的離心柱方法，探索一種簡單快速的多糖多酚植物雙生病毒基因組核酸的提取方法。

2 材料與方法

2.1 材料

植物樣品:朱槿曲葉病病株和朱槿健株，病株和健株葉片采集于福建省福州市郊區(qū)，經(jīng)過鑒定（病毒為Cotton leaf curl Multan virus）后保存于－70 ℃超低溫冰箱中備用。

2.2 CTAB法提取植物的總DNA

取約0.1g朱槿葉片（病株葉片3 份，即3 次重復(fù)），在液氮中研磨成粉末，加入700μL、65 ℃預(yù)熱的2×CTAB提取緩沖液，溫和混勻；65 ℃保溫30～60 min，期間不時搖動，使其充分混勻；用等體積的24∶1氯仿／異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合，于室溫下10 000r／min離心10min，回收水（上）相；用等體積的氯仿／異戊醇抽提，顛倒混勻，離心，回收上層水相；取上清，加入等體積的異丙醇，混勻，－20 ℃放置20min后12 000r／min離心10min以沉淀DNA；棄掉上清，加入適量的75%乙醇清洗、沉淀一次，隨后12 000 r／min離心10min；棄掉上清液，干燥后加入50μL 的TE溶液以溶解DNA，－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 離心柱法提取植物的總DNA

選用特別適用于多酚、多糖含量高的植物組織的植物總DNA 提取試劑盒DP305－02（北京天根生化科技有限公司），具體操作見說明書，朱槿葉片取0.1g（健株葉片1份、病株葉片3份，即3次重復(fù)），最后用50μL TE溶液溶解DNA，－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 改進(jìn)后的植物總DNA提取方法

取約0.1g 朱槿葉片（病株葉片3 份即3 次重復(fù)），在液氮中研磨成粉末，加入700μL、65 ℃預(yù)熱的2×CTAB提取緩沖液，溫和混勻；65 ℃保溫30min，期間不時搖動，使其充分混勻；用等體積的24∶1 氯仿／異戊醇抽提勻漿液，顛倒使充分混合，于室溫10 000r／min離心10min，回收水（上）相；加入0.7倍體積的A 溶液（4～5 mol／L 鹽酸胍，0.75 mol／L KAc，pH＝4.2～4.6），混勻；將混勻后的溶液加入離心柱（質(zhì)粒小提試劑盒DP103，北京天根生化科技有限公司）中，后面步驟參照質(zhì)粒小提試劑盒說明書；最后用50μL TE溶液溶解DNA，－20 ℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 PCR 檢測和靈敏性分析

以上述3種方法提取的植物總DNA 為模板，進(jìn)行PCR 檢測，引物引用謝艷等根據(jù)雙生病毒共同區(qū)及外殼蛋白基因保守序列設(shè)計的簡并引物PA 和PB，擴(kuò)增片段大小為500bp。

PCR 檢測:PCR 反應(yīng)體系按照TaKaRa的rTaq酶使用說明進(jìn)行，反應(yīng)程序為:94 ℃變性4min，35個循環(huán)的擴(kuò)增（94 ℃30s，52 ℃20s，72 ℃30min），最后72 ℃延伸10min，8 ℃保存20h。

靈敏性分析:取2.4節(jié)中獲取的DNA 4μL，進(jìn)行1、10、100、1 000、10 000 倍稀釋，然后按上述的PCR程序進(jìn)行實驗，以檢測改進(jìn)后的植物總DNA 提取方法的靈敏性。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，EB 染色后BioRad凝膠成像系統(tǒng)觀察記錄。

2.6 Real Time PCR 反應(yīng)

根據(jù)實驗室已測定的木爾坦棉花曲葉病毒DNAA 組分設(shè)計熒光定量引物，篩選得到擴(kuò)增效率高、反應(yīng)特異性強(qiáng)的一對引物 DLF／DLR（5′－CTGCCGAAGTTCAGACGCC－3′ 和 5′－CAGGATTATTCACCGGATACCCTA－3′），擴(kuò)增片段大小為147 bp。上述3種方法提取的DNA 各取2μL，稀釋100倍后使用。根據(jù)SYBR Premix Ex TaqTMII（TaKaRa Code:DRR081）試劑盒操作說明配制反應(yīng)液。用離心機(jī)快速離心含有反應(yīng)液的PCR 反應(yīng)管后，放入Eppendorf Realplex System 中，然后運行程序，采用兩步法進(jìn)行Real Time PCR 反應(yīng)。反應(yīng)條件如下:預(yù)變性，95 ℃30s，95 ℃5s，60 ℃30s，40個循環(huán)。為了建立PCR 產(chǎn)物的熔解曲線，擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后繼續(xù)從60 ℃緩慢加熱到95℃（每2s升高0.2 ℃）。

3 結(jié)果與分析

3.1 PCR 檢測結(jié)果

以上述3種方法提取的植物總DNA 為模板，進(jìn)行PCR 檢測，引物引用謝艷等［7］設(shè)計的通用簡并引物PA 和PB，結(jié)果如圖1（a），均能擴(kuò)增到預(yù)期的500bp大小的片段。說明3種方法均有效地抽提到雙生病毒的基因組核酸，改進(jìn)的方法和另外兩種方法一樣可以應(yīng)用。為了驗證改進(jìn)方法的靈敏性，以改進(jìn)后的方法提取的植物總DNA 為模板，依次稀釋1、10、100、1 000、10 000后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果如圖1（b），在PCR 反應(yīng)程序為35 個循環(huán)的條件下，模板稀釋1 000倍的情況下依然可以得到預(yù)期的片段，顯示改進(jìn)的方法有較高的靈敏度。

圖1中M 為DNA 標(biāo)記。圖1（a）中:1為陽性對照；2為陰性對照；3—5 為以CTAB 法提取植物的總DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增；6—8為以離心柱法提取植物的總DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增，9—11為改進(jìn)后的方法提取的植物總DNA為模板進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。圖1（b）中:1－5為以改進(jìn)后的方法提取的植物總DNA為模板，依次稀釋1、10、100、、10 000后進(jìn)行的PCR擴(kuò)增。

圖1 PCR 檢測

3.2 Real Time PCR 反應(yīng)結(jié)果

靈敏度分析只能定性地說明改進(jìn)后的方法可行，有較高的靈敏度，但無法比較3種方法的優(yōu)劣。為了比較3種方法提取雙生病毒基因組核酸的效率，采用熒光定量PCR 的方法進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。從圖2中可知，對于雙生病毒基因組產(chǎn)率來說，3 種方法中CTAB法效率最低，離心柱法次之，改進(jìn)方法最高。時間和價格比較見表1。從表1的數(shù)據(jù)來看，改進(jìn)后的方法在價格和時間上也有一定優(yōu)勢。

圖2 3種方法提取雙生病毒基因組核酸的效率比較

表1 3種方法提取雙生病毒基因組核酸的比較

4 討論

一些植物，如番茄、朱槿等，都富含多糖物質(zhì)，從富含多糖、多酚、單寧、色素及其他次生代謝物質(zhì)的植物中提取總DNA 的方法難度相對大于大多數(shù)的禾谷類及蔬菜類植物。從富含多糖的植物中提取DNA 時，由于多糖、單寧等物質(zhì)與DNA 會結(jié)合成黏稠的膠狀物，不易分離，常導(dǎo)致總DNA 產(chǎn)量低、質(zhì)量差、易降解等問題，影響了DNA 質(zhì)量和純度，嚴(yán)重的甚至不能作為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。因此，一旦處理不好，對實驗檢測或鑒定結(jié)果影響較大。傳統(tǒng)的CTAB 法提取總DNA 時，為了獲得更多的病毒基因組，多采用增加實驗材料，先大量抽提、隨后濃縮的方法［14］，這樣對儀器和實驗時間的要求必然增加。植物總DNA 提取的離心柱法提取總DNA 的效果較好，但是處理每個樣品的價格較貴（7 元／樣品），因而每個樣品質(zhì)量受限制（小于0.1g），最后得到的雙生病毒基因組量也有限。此外，植物總DNA 提取的離心柱法主要針對寄主的染色體DNA，而雙生病毒基因組是單鏈環(huán)狀的DNA，在大小和性質(zhì)上都與寄主基因組DNA 有一定的差異，跟雙鏈環(huán)狀的質(zhì)粒更接近，所以用該方法提取雙生病毒基因組可能會對其產(chǎn)率有一定的影響?？紤]到以上兩個方面的因素，在傳統(tǒng)雙生病毒基因核酸提取方法的基礎(chǔ)上，結(jié)合總DNA 提取的CTAB 法和質(zhì)粒提取的離心柱方法，發(fā)展了簡單快速的多糖植物雙生病毒基因組核酸的提取方法。從所得的數(shù)據(jù)來看，改進(jìn)后的方法無論在靈敏度、時間、價格和產(chǎn)率上都具有一定的優(yōu)勢，說明更適合于雙生病毒基因組核酸的提取和應(yīng)用。

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