蠟狀芽孢桿菌磷脂酶C基因在大腸桿菌中的異源表達

劉菲菲，張 梁,*，顧正華，丁重陽，石貴陽

(1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫 214122；2.工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

磷脂酶C(phospholipase C，PLC，EC3.1.4.3)，是一種水解甘油磷脂C3位點磷酯酰鍵生成甘油二酯和磷酸膽堿、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等的脂類水解酶[1]。根據(jù)作用底物特異性可以分為磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C(PC-PLC)、磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C(PI-PLC)和鞘磷脂特異性的鞘磷脂酶(SMase)，其中磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C除了具有磷脂酰膽堿活性外，還具有磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰絲氨酸(PS)活性。磷脂酶C水解產(chǎn)物甘油二酯是一種生理活性物質(zhì)，在細胞信號傳導(dǎo)途徑上起著第二信使的作用，能激活蛋白激酶C(PKC)而引起細胞增殖、分化、收縮、分泌和代謝等功能變化[2-3]，此外還具有明顯的抗血小板黏附、聚集等功能，對抗血小板新型藥物及抗靜脈血栓醫(yī)療方面的研究[4-6]意義重大。隨著對磷脂酶C研究的深入及工業(yè)發(fā)展的需求，磷脂酶C的應(yīng)用價值逐漸被挖掘開發(fā)，已經(jīng)逐漸從藥品生產(chǎn)延伸至油脂精煉[1]、食品加工、磷脂改性等領(lǐng)域[7-8]。例如植物油行業(yè)，粗制植物油中含有的磷脂、痕量金屬等造成其色澤或口味變差，利用磷脂酶A(PLA)和磷脂酶C的混合物進行酶法脫膠[9]或者說是酶催化精煉，可以完全除去磷脂，比水、酸或苛性堿脫膠具有更好的油產(chǎn)率和經(jīng)濟效益；食品工業(yè)中磷脂酶C可用來改善面包的冷凍保存，生面團烤制時在面包表面產(chǎn)生的老化、緩和梨皮狀表皮等；而最近磷脂酶C作為一種新型食品添加劑勢必會推動磷脂酶C的廣泛應(yīng)用和研究。

微生物來源磷脂酶C較動植物來源磷脂酶C具有生產(chǎn)周期短、結(jié)構(gòu)簡單，可工業(yè)化大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢，但野生菌株產(chǎn)量低、分離純化耗資大[10]，使得高純度磷脂酶C商業(yè)化生產(chǎn)難以實現(xiàn)；而且大多數(shù)來源菌株都具有病原性，在食品安全性方面存在一定的隱患。本實驗篩選出一株產(chǎn)磷脂酶C菌株Bacillus cereus 12并以其染色體為模板，利用pET系統(tǒng)載體構(gòu)建磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因重組大腸桿菌，初步嘗試?yán)迷撏緩綄崿F(xiàn)磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因的異源高效表達，為后續(xù)的工作提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus 12為本實驗所篩選的高產(chǎn)磷脂酶C菌株，E. coli JM109、BL21(DE3)菌株及載體pET28a(+)為本實驗室(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室)保藏。

1.2 試劑與培養(yǎng)基

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、DNA marker、Protein marker 加拿大Fermentas公司；T4 DNA連接酶、TaqDNA聚合酶、dNTPs、pMD18-T載體 日本TaKaRa公司；DNA片段純化試劑盒、質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒 北京博大泰克生物技術(shù)公司；p-NPPC 美國Sigma公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

卵黃LB固體培養(yǎng)基：在LB固體培養(yǎng)基中添加2%卵黃；硼砂卵黃固體培養(yǎng)基：NaCl 0.66g/100mL、硼酸1.09g/100mL、硼砂0.19g/100mL、瓊脂1.5g/100mL、卵黃液2%，pH7.2～7.4。

1.3 方法

1.3.1 產(chǎn)磷脂酶C菌株的篩選

以本實驗室保藏的600株細菌為出發(fā)菌株，分別點種于卵黃LB平板上進行初篩，37℃培養(yǎng)過夜，篩選出乳白色暈圈較大的15株進行發(fā)酵培養(yǎng)，于等距放在硼砂卵黃平板上的牛津杯中加入200μL發(fā)酵液，每個做3個平行，37℃溫育24h進行復(fù)篩，挑取暈圈最大的菌株進行保藏。

1.3.2 基因組DNA的提取

蠟狀芽孢桿菌基因組DNA的提取參考分子克隆實驗指南[11]相關(guān)方法進行。

1.3.3 pcplc基因的克隆

以NCBI上報道的ATCC10987的pcplc基因為模板設(shè)計PCR引物p1/p2，見表1。

表 1 所用引物Table 1 Primers used in this study

以Bacillus cereus 12染色體為模板，以p1/p2為引物進行PCR擴增。PCR擴增體系為：dNTPs、10×Buffer各2.5μL，上下游引物各0.5μL，模板1μL，滅菌的雙蒸水18μL，Taq酶0.3μL。PCR擴增條件為：95℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，54℃退火30s，72℃延伸90s，30個循環(huán)后72℃延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳進行結(jié)果分析，PCR產(chǎn)物純化后，用T4 DNA連接酶連接，插入pMD18-T載體，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109，藍白斑篩選陽性克隆。挑取陽性克隆接種至Amp抗性LB培養(yǎng)基中，提質(zhì)粒用EcoRⅠ酶切驗證。將驗證正確的克隆送華大基因測序。測序正確的重組質(zhì)粒命名為pMD18-pcplc1，－70℃甘油管保存。

1.3.4 大腸桿菌表達質(zhì)粒的構(gòu)建

提取pMD18-pcplc1質(zhì)粒，用EcoRⅠ進行酶切膠回收目的條帶后，與經(jīng)EcoRⅠ線性化的pET28a于16℃培養(yǎng)箱連接過夜，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細胞，氨芐抗性平板篩選，挑取轉(zhuǎn)化子用T7啟動子引物和目的基因下游引物進行菌落PCR，挑取菌落PCR正確的轉(zhuǎn)化子大提，然后用BamHⅠ酶切驗證連接正反。送華大基因用T7啟動子/終止子引物測序，正確的重組質(zhì)粒命名為pET28a-pcplc1，將測序正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌BL21(DE3)，－70℃甘油管保存。

1.3.5 重組菌的誘導(dǎo)表達及SDS-PAGE凝膠電泳檢測

將重組菌株pET28a-pcplc1/DE3以及空載對照pET28a/DE3于37℃振蕩培養(yǎng)過夜，次日以4%接種量轉(zhuǎn)接至50mL卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基，37℃、200r/min培養(yǎng)至OD600nm為0.6～0.8時，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，25℃誘導(dǎo)6h。

誘導(dǎo)結(jié)束后6000r/min離心10min收集菌體，并用10mL濃度為25mmol/L Tris-HCl(pH7.2)緩沖液重懸菌體，菌體于冰浴中超聲波破碎至澄清，8000r/min離心10min，收集上清，取20μL樣品加入5×Loading buffer，煮沸10min，12000r/min離心10min，上樣量15μL，采用10%分離膠、5%濃縮膠進行SDS-PAGE鑒定蛋白表達與否。

1.3.6 磷脂酶C的酶活力測定

硼砂卵黃平板牛津杯法測酶活力：取200μL發(fā)酵液置于等距放置在硼砂卵黃平板上的牛津杯中，37℃溫育24h，所產(chǎn)生的乳白色暈圈的大小即代表酶活力的高低。由于該方法磷脂酶直接作用于底物卵磷脂，所以成本低廉，應(yīng)用較為廣泛。

NPPC底物法測磷脂酶C酶活力：根據(jù)磷脂酶C能水解甘油磷脂結(jié)構(gòu)類似物對硝基苯酚磷酸膽堿(p-NPPC)產(chǎn)生有色基團(對硝基苯酚)，該物質(zhì)在410nm波長處有最大吸收峰，可利用p-NPPC為反應(yīng)底物，于410nm波長處測定反應(yīng)液的吸光度，并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出PLC水解p-NPPC產(chǎn)生對硝基苯酚的量，從而定量檢測磷脂酶C活力大小。酶反應(yīng)系統(tǒng)組成：0.25mol/L Tris-HCl (pH 7.2)、0.1mmol/L ZnCl2、60g/100mL山梨醇、10mmol/L p-NPPC，在反應(yīng)系統(tǒng)中加入200μL發(fā)酵酶液于37℃反應(yīng)30min，立刻用分光光度計測410nm波長處吸光度。酶活單位的定義：在pH7.2、37℃的條件下，每分鐘水解p-NPPC產(chǎn)生1nmol的對硝基苯酚所需的酶量為1個酶活力單位(U)。由于底物昂貴，而且p-NPPC缺乏磷脂尾端結(jié)構(gòu)，不能真實地反映出磷脂酶C的水解程度[2]，故初步鑒定采用硼砂卵黃平板牛津杯法。

1.3.7 重組菌株生長曲線的測定

從平板上挑取重組大腸桿菌單菌落接種于裝有20mL卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基的100mL三角瓶中，37℃、200r/min過夜培養(yǎng)，按4%的轉(zhuǎn)接量轉(zhuǎn)接于若干裝有50mL卡那霉素抗性LB液體培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，37℃、200r/min振蕩培養(yǎng)，定點取樣測OD600nm值，實驗過程中做3組平行實驗。

1.3.8 誘導(dǎo)條件的初步優(yōu)化

誘導(dǎo)時機、誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、誘導(dǎo)時間對產(chǎn)酶的影響隨重組蛋白的種類不同而有所不同。本實驗在方法1.3.5節(jié)的基礎(chǔ)上通過改變單因子的方法進行誘導(dǎo)，根據(jù)硼砂卵黃平板牛津杯法產(chǎn)生的乳白色暈圈直徑大小來鑒定酶活的高低，每個因素做3個平行。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)磷脂酶C菌株的篩選結(jié)果

由圖1可知，最終篩選出3株暈圈較大的菌株，分別為95-3-3、642-16-4、12-3-1，暈圈直徑都達到22mm，經(jīng)鑒定95-3-3為熒光假單胞菌，642-16-4、12-3-1為蠟狀芽孢桿菌。本實驗選取642-16-4為出發(fā)菌株，重新命名為Bacillus cereus 12。

圖 1 產(chǎn)PLC的部分初篩(a)和部分復(fù)篩(b)結(jié)果Fig.1 Screening of PLC

2.2 pcplc基因的克隆

根據(jù)NCBI公布的ATCC10987的pcplc基因設(shè)計引物時發(fā)現(xiàn)該基因由信號肽、前肽和成熟肽構(gòu)成，考慮前肽的助折疊功能，引物設(shè)計中包含前肽。提取蠟狀芽孢桿菌Bacillus cereus 12的基因組DNA，用p1/p2引物擴增，瓊脂糖凝膠電泳表明在約800bp處有明顯的條帶如圖2所示，命名為pcplc1。用純化試劑盒回收該片段，與pMD18-T連接后用EcoRⅠ進行酶切驗證，驗證結(jié)果如圖3中789bp和2692bp兩條帶，分別對應(yīng)目的基因片段大小和載體大小。挑取正確的轉(zhuǎn)化子送華大基因測序，測序結(jié)果顯示擴增序列與ATCC10987的pcplc基因序列比對相似度97%。

圖 2 目的基因擴增結(jié)果Fig.2 PCR amplification of the target gene

圖 3 pcplc1-pMD18-T EcoRⅠ酶切驗證Fig.3 Restriction enzyme digestion analysis of pcplc1-PMD18T by EcoRI

2.3 重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

該表達質(zhì)粒利用N端His-Tag融合標(biāo)簽，在EcoRⅠ位點將目的基因連接到載體中，構(gòu)建方法如1.3.4節(jié)。利用目的基因和載體上共有的BamHⅠ位點來驗證pcplc1基因插入的正反，如果正接則得到577bp和5578bp兩條片段，如果反接則得到225bp和5930bp，結(jié)果如圖4。挑取驗證正確的轉(zhuǎn)化子進行測序，測序結(jié)果顯示閱讀框正確，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，將其命名為pET28a-pcplc1。

圖 4 重組質(zhì)粒pET28a-pcplc1 Bam HⅠ酶切驗證Fig.4 Restriction enzyme digestion analysis of pET28a-pcplc1 by BamHⅠ

2.4 重組質(zhì)粒在大腸桿菌中的表達

將驗證正確的包含前肽的重組質(zhì)粒pET28a-pcplc1轉(zhuǎn)化感受態(tài)表達菌株BL21(DE3)，并以空載pET28a(+)和不含前肽的重組質(zhì)粒pET28a-pcplc2(構(gòu)建方法同pET28apcplc1)作為對照轉(zhuǎn)化BL21(DE3)，按上述1.2.4節(jié)方法進行誘導(dǎo)及SDS-PAGE電泳鑒定。結(jié)果如圖5所示，構(gòu)建的重組菌pET28a-pcplc1/DE3、pET28a-pcplc2/DE3成功表達了分子質(zhì)量分別約為33kD和31kD的重組蛋白，與預(yù)期值相符，說明磷脂酶C基因pcplc1在大腸桿菌DE3中得以表達。

圖 5 大腸桿菌重組磷脂酶C的SDS-PAGE電泳Fig.5 SDS-PAGE analysis of recombination PLC

2.5 重組蛋白活性驗證

利用1.3.6節(jié)所述的卵黃硼砂平板法檢測磷脂酶C活性，結(jié)果如圖6顯示，pET28a-pcplc1/DE3破碎上清中的重組蛋白有明顯乳白色暈圈，而pET28a-pcplc2/DE3和空載對照均沒有，說明含有前肽的重組蛋白具備磷脂酶C活性。原因推測是酶催化位點位于成熟肽N端位置，距離前肽較近，酶活性的體現(xiàn)必須基于前肽的助折疊功能。

圖 6 重組蛋白活性驗證Fig.6 Verification of recombinant enzyme activity

2.6 重組菌pET28a-pcplc1/DE3生長曲線的測定及誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.6.1 重組菌生長曲線的測定

重組菌的誘導(dǎo)發(fā)酵產(chǎn)酶與誘導(dǎo)條件密切相關(guān)，在確定最佳的誘導(dǎo)條件之前需要先研究重組菌的生長曲線。根據(jù)此生長曲線選擇適應(yīng)期、對數(shù)生長前期、對數(shù)生長中期、對數(shù)生長后期進行誘導(dǎo)。按方法1.3.7節(jié)測定生長曲線，結(jié)果如圖7所示，0～1h為適應(yīng)期，1～6h為對數(shù)生長期。

圖 7 重組菌生長曲線Fig.7 Growth curve of recombinant strain pET28a(+)-pcplc1/DE3

2.6.2 最佳誘導(dǎo)起始時間的確定

圖 8 誘導(dǎo)時機對酶活力的影響Fig.8 Effect of induction time on enzyme activity

誘導(dǎo)時機對菌體產(chǎn)酶有著較大影響，在對數(shù)生長期菌體生長狀況良好，體內(nèi)各種酶的代謝處于旺盛階段，此時誘導(dǎo)利于外源蛋白的合成。誘導(dǎo)時間過早，菌體太少往往會降低外源蛋白產(chǎn)量；誘導(dǎo)時間過遲，細菌過老自身代謝能力下降，不利于外源基因表達。因此按方法1.3.8節(jié)，轉(zhuǎn)接后分別選取菌體生長0.5、1、1.5、2、3、5h時添加IPTG進行誘導(dǎo)。結(jié)果如圖8所示，酶活力隨著時間的延長而逐漸增大，在對數(shù)前期1.5h達到最大值，隨后酶活力基本上保持不變，故最佳誘導(dǎo)起始時間為轉(zhuǎn)接后1.5h。

2.6.3 IPTG最佳濃度的確定

IPTG作為誘導(dǎo)劑，能夠啟動lac啟動子的轉(zhuǎn)錄，但本身均有一定的毒性，濃度過高會抑制菌體的生長，另外IPTG價格昂貴，所以IPTG的添加并不是越多越好。按方法1.3.8節(jié)，IPTG濃度選取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L進行誘導(dǎo)。由圖9可知，在IPTG濃度為0.2mmol/L時酶活力達到最大，酶活力隨著IPTG濃度的增加逐漸降低，故最佳誘導(dǎo)劑濃度為0.2mmol/L。

圖 9 IPTG濃度對酶活力的影響Fig.9 Effect of IPTG concentration on enzyme activity

2.6.4 最佳誘導(dǎo)溫度的確定

圖 10 誘導(dǎo)溫度對酶活力的影響Fig.10 Effect of induction temperature on enzyme activity

溫度決定著微生物體內(nèi)新陳代謝的酶催化反應(yīng)，大腸桿菌的最適生長溫度為37℃，誘導(dǎo)溫度過高重組蛋白易折疊錯誤而以包涵體的形式存在；溫度過低菌體生長緩慢，表達量降低。本實驗依據(jù)方法1.3.8選取了4個溫度20、25、30、37℃，考察了誘導(dǎo)溫度對酶活的影響，結(jié)果如圖10所示，隨著溫度的升高酶活在25℃時達到最大，隨后降低，故選取發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳溫度為25℃。

2.6.5 最佳誘導(dǎo)時間的確定

依據(jù)方法1.3.8節(jié)，分別誘導(dǎo)2、4、6、8、10、12h研究誘導(dǎo)時間長短對產(chǎn)酶的影響。結(jié)果如圖11所示，酶活力在4h達到最大值，隨后隨著時間的遞增而減小，在8h以后酶活力相對變化較小，故最佳的誘導(dǎo)時間為4h。

圖 11 誘導(dǎo)時間對酶活力的影響Fig.11 Effect of induction time on enzyme activity

2.7 最佳誘導(dǎo)條件下重組菌特性

綜上所述，重組大腸桿菌pET28a-pcplc1/DE3最佳誘導(dǎo)條為：轉(zhuǎn)接量4%，37℃培養(yǎng)1.5h后添加IPTG至終濃度為0.2mmol/L，25℃誘導(dǎo)培養(yǎng)4h。在最佳誘導(dǎo)條件下，重組磷脂酶C在硼砂卵黃平板上暈圈直徑較優(yōu)化前增大約9mm，細胞破碎上清中重組磷脂酶C酶比活力為(30.24±0.18)U/mL。

3 討 論

磷脂酶C基因結(jié)構(gòu)及功能[3]的研究開始于國外20世紀(jì)60年代，隨后1997年Cristina等[12]在大腸桿菌中以包涵體的形式克隆表達了蠟狀芽孢桿菌磷脂酶C基因，近年來開始出現(xiàn)少量不同表達體系的克隆表達[13-14]及有關(guān)工業(yè)應(yīng)用的報道[15]。然而目前國內(nèi)相關(guān)研究尚淺，2005年陳濤[16]對產(chǎn)磷脂酶C野生菌株Bacillus cereus Shenzhen754-1進行紫外線和60-γ射線誘變處理將酶活力提高至16.45U/mL；2007年高林等[17]對Bacillus cereus Shenzhen754-1進行培養(yǎng)條件的優(yōu)化產(chǎn)酶水平提高至26U/mL；同年王常高等[7]對篩選到的一株Bacillus mycoides進行了分離純化和部分酶學(xué)特性研究，結(jié)果純化出的蛋白具有高分解甘油磷脂結(jié)構(gòu)類似物p-NPPC的能力卻沒有底物卵磷脂的分解能力；2010年詹逸舒[18]篩選到一株Bacillus cereus Z-13優(yōu)化后酶活力23.31U/mL。由于野生菌株單位產(chǎn)量低，磷脂酶C的分離純化一般采用硫酸銨沉淀初步分離，然后采用離子交換層析、凝膠柱層析等進行進一步分離純化。分離過程復(fù)雜，硫酸銨消耗量大[19]，給成本帶來負擔(dān)。國內(nèi)關(guān)于細菌來源磷脂酶C基因的克隆表達的報道很少，2007年任龍等[10]嘗試?yán)梅肿涌寺〉氖侄翁岣弋a(chǎn)量，將Bacillus cereus Shenzhen754-1 磷脂酰肌醇特異性磷脂酶C基因克隆進pGEX-KG載體，在BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達出以包涵體形式存在的約38kD大小的重組蛋白，但初始復(fù)性沒有測到磷脂酶C活性。隨著磷脂酶C應(yīng)用范圍的拓展，單純性從野生菌株出發(fā)來提高生產(chǎn)磷脂酶C存在諸多弊端。

本實驗利用pET系統(tǒng)載體從分子生物學(xué)途徑成功實現(xiàn)了磷脂酰膽堿特異性磷脂酶C基因在大腸桿菌BL21(DE3)中的可溶性表達，避免了包涵體復(fù)性帶來的各種麻煩，而且該重組磷脂酶C的N端帶有6HIS融合標(biāo)簽，為下一步的快速分離純化提供了依據(jù)。研究中發(fā)現(xiàn)，前肽的存在是保證酶活的前提；直接將成熟肽基因進行克隆表達，得到的是沒有活性的重組蛋白。在誘導(dǎo)前提一致的情況下，誘導(dǎo)結(jié)束時能產(chǎn)生活性重組蛋白的重組菌菌體濃度是其他兩個對照菌體濃度的一半，由此證實了活性蛋白對菌體有一定的毒素作用，從而阻礙菌體的生長，猜測毒素作用是因為該酶的作用底物是磷脂，而且能參與一些代謝調(diào)控，從而引起不利于菌體生長的反應(yīng)。后續(xù)工作將利用其N端6HIS標(biāo)簽進行分離純化，獲得的純酶用于研究重組磷脂酶C的酶學(xué)性質(zhì)及一些應(yīng)用研究，并將該磷脂酶C基因在芽孢桿菌和畢赤酵母等更優(yōu)越更安全的表達體系中進行表達，從而獲得更高表達量的活性蛋白，為磷脂酶C在產(chǎn)業(yè)化及工業(yè)應(yīng)用方面做出貢獻。

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